赵晨煊，李瑞婷

（广州工商学院，广东 广州 510850）

生物体内的氧化应激反应可以不断产生自由基，抗氧化剂能捕获并清除这些自由基，从而减少自由基对机体的损伤，具有类激素、降血压、抗氧化、抗血栓、抗菌等生理活性功能[1]。目前，大量研究发现食源性动植物蛋白经酶解后，分离纯化得到的酶解产物具有抗氧化能力，且该能力来源于蛋白酶解产物中的多肽，如大豆多肽、玉米多肽等都逐渐受到国内外学者的关注。

天然抗氧化肽主要来源于动植物蛋白。动物蛋白方面，尤其是从海洋食物中提取得到的抗氧化产品多以鱼类为原料，提取出具有较强抗氧化活性的多肽。Wang Xueqin 等人[2]研究发现鲭鱼蛋白水解物分离得到的分子量为1 644 kDa 的多肽具有较强的DPPH 自由基清除能力，并得出鲭鱼蛋白水解物可作为抗氧化肽的原料。Siahoppsh A 等人[3]研究发现水解度为129.38 mg/mL 的虎斑乌贼胃蛋白酶提取物的FRAP 指标是21.75 mg/mL，表明该提取物具有抗氧化活性，并推测该作用是乌贼器官中的蛋白质经水解后引起的。除此之外，其他动物蛋白质来源的抗氧化肽也是科学家研究的热点，Chen Chen 等人[4]采用木瓜蛋白酶水解鸡蛋白蛋白，并通过超滤、凝胶层析等方法得到2 段具有较强清除自由基能力的肽段，其系列为Tyr-Leu-Gly-Ala-Lys（551.54 Da） 和Gly-Gly-Leu-Glu-Pro-Ile-Asn-Phe-Gln（974.55 Da）。植物蛋白方面，近几年对大豆蛋白中的抗氧化肽的研究甚多。吴建中[5]从5 种蛋白酶中筛选出木瓜蛋白酶水解之后的大豆蛋白具有较高的抗氧化性，采用Sephadex G-25 凝胶过滤层析和高效凝胶过滤色谱进行分离，确认分子量约1 100 Da 的多肽具有抗氧化活性的。徐力等人[6]以低温冷榨豆粕为原料，对大豆蛋白的小分子酶解产物的抗氧活性进行了研究，最终获得了平均分子量800 Da 的小分子活性肽（SBP），并得知SBP 有与GSH 相似的抗氧化活性，即在活性肽终质量浓度为8 mg/mL 时，对邻苯三酚自氧化抑制率达到了70%。王可[7]研究发现玉米抗氧化肽也具有与GSH 同样的抗氧化活性，组分CAPS-1 的质量浓度为10 mg/mL 时，其对DPPH 自由基的清除率可达84.75%；由王琪[8]的研究得知，小麦胚芽蛋白的酶解及其产物经脱盐后，质量浓度为10 mg/mL 时其对DPPH 自由基清除率与抗坏血酸相似，可达80%。

文冠果是我国特有的木本食用油料树种之一，分布广、适应性强、种植面积大。文冠果油粕是文冠果种仁制油剩余的副产品，产量大，多作为饲料。据文献报道，文冠果种仁蛋白质中有17 种氨基酸且必需氨基酸的种类齐全，具有良好的开发利用价值[9-10]。鉴于油粕未得到充分利用，且综合利用水平和经济效益低下。以文冠果油粕为原料，对文冠果油粕蛋白的酶解产物中活性肽的抗氧化性做出评价。

1 材料和方法

1.1 材料与化学试剂

文冠果油粕，市售；牛血清蛋白、考马斯G-250、木瓜蛋白酶、1.1-二苯基苦基苯肼（DPPH）、Tris-HCl 缓冲液、邻苯三酚、重蒸水、谷胱甘肽GSH、Sephadex G-25 凝胶，北京科百奥试剂公司提供；抗氧化阴离子自由基及产生超氧阴离子自由基测试盒、羟自由基测定试剂盒，南京建成生物工程研究所提供；其他分析醇，由实验室提供。

1.2 仪器与设备

高效冷冻离心机，Thermo Fisher SCIENTIFIC 产品；KDY-9830 型凯氏定氮仪，北京市通润源机电技术有限责任公司产品；全波段分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司产品；1.6 cm×80 cm 层析柱，北京科百奥试剂公司产品；IHID-3 型紫外检测仪、HD-A 型电脑采集器，上海沪西分析仪器厂有限公司产品；SENCO R-201 型旋转蒸发器，上海申顺生物科技有限公司产品；超滤Vivaflow 50、Omega 滤膜，德国Sartorious Stedim 产品；HH 系列数显恒温水浴锅，金坛市科析仪器有限公司产品。

1.3 文冠果油粕预处理

文冠果油粕经粉碎机粉碎后过80 目标准筛，室温下在石油醚中浸泡2 h（料液比为1∶4），以转速4 000 r/min 离心20 min，滤去上清液，沉淀物置于通风橱风干并过夜，得到脱脂文冠果油粕。

1.4 传统Osborne 法分级分离4 种蛋白

称取经预处理的油粕50 g，从其中提取4 种分类蛋白，方法参照文献[11]，稍作改动。

1.5 改良Osborne 法分级分离4 种蛋白

（1）清蛋白提取。称取脱脂文冠果粕，按照料液比1∶20（g∶mL） 加入蒸馏水，充分搅拌后，于35 ℃下超声提取，接着在40 ℃恒温下搅拌60 min，以转速4 000 r/min 离心20 min，离心后得到的沉淀用于下一步蛋白提取，上清液即清蛋白提取液。之后按照表1 所示方法处理，将上清液以转速4 500 r/min 离心15 min，收集沉淀，上清液于4 ℃下静置一段时间后离心和抽滤，合并沉淀和滤渣，之后用冷冻干燥机冻干称质量。

（2） 球蛋白提取。取（1） 中第一次离心得到的沉淀物，按照料液比1∶20（g∶mL） 加入10%NaCl 溶液，后续收集蛋白提取液的步骤与清蛋白提取方法相同，之后按照表1 所示方法处理，以转速4 500 r/min离心15 min，收集沉淀，上清液于4 ℃下静置一段时间后上层出现未沉淀的蛋白，抽滤后将滤渣和上述沉淀合并，之后用冷冻干燥机冻干称质量。

（3） 醇溶蛋白提取。取（2） 中第一次离心得到的沉淀物，按照料液比1∶20（g∶mL） 加入70%乙醇，后续提取蛋白的方法与清蛋白提取方法相同，得到的蛋白提取液采用真空旋转蒸发仪在78.1 ℃下除去乙醇，得到蛋白浓缩溶液，之后再用冷冻干燥机冻干称质量。

（4） 谷蛋白提取。取（3） 中离心得到的沉淀物，按照料液比1∶20（g∶mL） 加入0.05 mol/L NaOH 溶液，后续收集蛋白提取液的步骤与清蛋白提取方法相同，之后按照表1 所示方法处理，以转速4 500 r/min 离心15 min，收集沉淀，之后用冷冻干燥机冻干称质量。

4 种蛋白提取液的处理方法见表1。

表1 4 种蛋白提取液的处理方法

1.6 测定油粕粗蛋白含量与4 种蛋白提取率

（1） 粗蛋白含量。文冠果油粕蛋白含量测定按GB 5511—85 微量凯氏定氮法测定。

（2） Osborne 法分级分离4 种蛋白的提取率。采用电子天平对不同溶剂分级分离得到的4 种蛋白称质量，并分别计算提取率。

1.7 4 种蛋白的酶解及其酶解产物的分离

采用超滤的方法对蛋白酶解产物进行分离。首先，将分离得到的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白分别用木瓜蛋白酶进行酶解，之后分别用5，10 kDa的超滤膜分离收集相对分子量为5～10 kDa 和＜5 kDa的蛋白水解产物，具体操作方式如下：

准确称取一定量的蛋白样品溶于蒸馏水中，用0.1 mol/L 的NaOH 调整溶液pH 值到7.0，添加木瓜蛋白酶（[E]/[S]=1/2），在振摇培养器中55 ℃下反应4 h 后，于100 ℃下灭酶3～5 min，以转速5 000 r/min离心15 min，酶解产物过0.45 μm 的水系膜，之后分别用10，5 kDa 的超滤膜分离并收集相对分子量为5～10 kDa，＜5 kDa 的4 种蛋白的酶解产物，最后将收集到的酶解液进行冷冻干燥处理并置于-20 ℃下保存，作为下一步各蛋白酶解产物抗氧化能力测定的样品。

1.8 XPHs 对自由基清除能力的测定

采用下述2 个指标分别对4 种蛋白不同相对分子量的酶解产物和谷胱甘肽GSH（阳性对照） 的抗氧化活性进行测定，比较分析不同分子量的酶解产物的抗氧化性，并依据测定指标筛选出抗氧化活性最强的蛋白酶解产物，进一步通过凝胶层析分离纯化。

（1） 对DPPH·的清除能力。样品溶液配制，取1 mg/mL 的样品溶于4 mL 溶液中，配制质量浓度为0.25 mg/mL 的溶液。

样品组：取2 mL 样品溶液加入2 mL DPPH·溶液（0.1 mmol/L，溶于95%乙醇），混匀后在室温下避光反应30 min，于波长517 nm 处测定其吸光度Ai；

空白组：2 mL 95%乙醇溶液，加入2 mL 去离子水，于波长517 nm 处测定其吸光度A0；

对照组：2 mL DPPH·溶液，加入2 mL 去离子水，在相同波长处测定其吸光度Aj。

DPPH 自由基清除率按以下公式计算：

谷胱甘肽清除DPPH 自由基能力的测定方法同上述测定XPHs 清除DPPH 自由基能力的方法一致。

（2） 对·OH 的清除能力。准确称取各样品溶于一定量的蒸馏水中，配制成质量浓度为1 mg/mL 的溶液，采用羟基自由基测定试剂盒测定各样品的抗氧化活性。谷胱甘肽清除羟基自由基能力的测定方法同上述测定XPHs 清除羟基自由基能力的方法一致。

1.9 Sephadex G-25 凝胶层析分离

将处理好的Sephadex G-25 装成1.6 cm×80 cm的玻璃层析柱，用纯净水将谷蛋白酶解产物相对分子量＜5 kDa 的组分（XGLPH-Ⅱ） 配置成20 mg/mL的溶液，上样量为5 mL，过0.22 μm 滤膜（水相），用纯净水以20 mL/h 的流速洗脱，同时用紫外检测仪检测波长280 nm 处的吸光值，以得出检测组分中是否具有更小相对分子量的活性肽。

2 结果与分析

2.1 文冠果油粕粗蛋白含量

文冠果油粕是文冠果种仁制油产生的副产品，含丰富的蛋白质。经凯氏定氮法测得，文冠果油粕粗蛋白含量为37.45%。在预处理过程中先过80 目筛后脱脂，致使大量蛋白颗粒丢失，且脱脂只是在石油醚中浸泡，时间短且未进行搅拌，导致脱脂不充分，部分蛋白仍与油脂结合，影响粗蛋白含量测定。

2.2 Osborne 法分级提取4 类蛋白

采用传统Osborne 法分级提取文冠果油粕中的4 种蛋白，传统工艺中仅仅采用油粕在溶剂中加热并不断搅拌促进蛋白溶解的方式。

传统Osborne 法分级分离蛋白的组成见表2。

表2 传统Osborne 法分级分离蛋白的组成

其中，球蛋白的提取率最高，为44.83%；谷蛋白次之，提取率为44.94%；清蛋白和醇溶蛋白的提取率都较低，不足5%。

依据相关文献[12]，对Osborne 分级提取蛋白的方法进行了优化。按照改良Osborne 法分级分离蛋白，分别用蒸馏水、10%NaCl、70%乙醇和0.05 mol/L NaOH 顺序提取4 种蛋白组分，之后分别称质量，得到文冠果油粕蛋白分级分离组分的组成。与传统Osborne 法不同，采用改良Osborne 法后，谷蛋白的提取率最高，为53.87%；球蛋白次之，其提取率为24.59%；醇溶蛋白清蛋白的提取率分别为17.65%和3.88%。

综上所述，Osborne 法改良前后对4 种蛋白的提取率有很大的影响，因此对改良前后的蛋白总提取率和4 种蛋白提取率做了分析比较。

改良Osborne 法分级分离蛋白的组成见表3。

表3 改良Osborne 法分级分离蛋白的组成

Osborne 法分级分离蛋白的提取率见图1。

由图1 可知，总体来说，采用改良Osborne 法后，清蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白和球蛋白的提取率明显提高，4 种蛋白的总提取率也显著增大。其中，醇溶蛋白提取率显著增大，从3.92%升至17.65%；4 种蛋白总提取率提高了52.67%。因此，通过优化得到改良Osborne 法最佳工艺参数为料液比1∶20（g∶mL），超声功率600 W，超声温度35 ℃，水浴时间30 min，闪时提取10 次，每次15 s，间隔5 s；之后再在恒温40 ℃下磁力搅拌60 min，以转速4 000 r/min 离心20 min；离心后收集上清液按照表2所示方法处理后，以转速4 500 r/min 离心15 min，收集沉淀，上清液于4 ℃下静置一段时间后再进行离心和抽滤，合并沉淀和滤渣，之后用冷冻干燥机冻干，即可得到分类蛋白。

试验中，改良Osborne 法提取蛋白工艺优势在于采用了超声波和闪时提取辅助提取蛋白的工艺，极大程度地提高了蛋白提取率。孙英等人[13]研究了超声预处理对茶籽粕多肽抗氧化活性的影响，结果显示以茶粕抗氧化肽的还原力为评价指标，超声波处理后的与未处理的相比较，多肽对羟基自由基、超氧自由基的清除率和还原力吸光值的增长率分别为79.33%，71.72%，113.8%。闪提过程中，机械剪切力作用产生大量新生表面，蛋白质快速溶解和扩散，提取率逐渐提高。李雅松等人[14]采用优化后的闪时提取工艺提取栗叶蛋白，发现随着时间的延长，栗叶蛋白得率显著增大，在2 min 内蛋白提取率增大3%。综上所述，试验中改良Osborne 法提取蛋白的工艺可显著提高蛋白的提取率。

Osborne 法分级分类提取蛋白是试验关键的一步，为后期试验中对蛋白酶解产物多肽抗氧化活性的研究准备出丰富的原料蛋白。对比相关文献，试验在提取蛋白过程中也存在缺陷，可在以后的研究中进一步工艺优化。经分析，可能导致以上试验结果的原因如下，油粕的预处理过程很重要，其脱脂和粉碎程度直接影响到蛋白颗粒在4 种溶剂种的溶解度，而在试验中，脱脂时间短、未搅拌，导致脱脂不充分，部分蛋白仍与油脂结合，影响蛋白溶解。

2.3 XPHs 对DPPH 自由基的清除能力

DPPH 自由基在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，在517 nm 处有一个特征吸收峰，自由基清除剂可与DPPH 自由基的孤对电子配对，使其在最大吸收波长处的吸光度变小，颜色从紫色褪至黄色。因此，通过测定吸光度的变化可评价对DPPH 自由基的捕获能力。该方法灵敏、简便、实用且重现性好，多用于天然有机化合物和植物提取物的抗氧化活性评价[15]。

XPHs 对DPPH·的清除率见图2。

由图2 可知，文冠果油粕蛋白酶解产物多肽具有抗氧化活性，清除DPPH 自由基的能力按从大到小 排 列 依 次 为XAPH-II＞XPPH-I＞XAPH-I＞XGPHII＞XGPH-I＞XPPH-II＞XGLPH-I＞XGLPH-II。谷 蛋 白和清蛋白的酶解产物中分子量＜5 kDa 的多肽抗氧化能力高于分子量5～10 kDa 的多肽抗氧化能力，而醇溶蛋白和球蛋白的分子量＜5 kDa 的酶解产物的抗氧化能力低于分子量5～10 kDa 的抗氧化能力；在同浓度条件下，分子量＜5 kDa 的清蛋白酶解产物多肽对DPPH 自由基的清除率最高，可达64.81%。醇溶蛋白、谷蛋白、球蛋白的酶解产物多肽对DPPH 自由基的清除能力相近，清除率在20%～40%，其中球蛋白酶解产物多肽分子量＜5 kDa 对DPPH 自由基的清除率最低，低于10%。活性肽的分子量在2 kDa 以下，抗氧化能力与其分子量大小有密切关系，且一般含2～10 个氨基酸[16]。这与试验的结果一致，可以得出，以清除DPPH 自由基能力为指标，文冠果油粕蛋白酶解产物多肽中分子量＜5 kDa 的清蛋白酶解产物具有较高的抗氧化活性，而同浓度下相同分子量范围的醇溶蛋白和球蛋白酶解产物多肽的抗氧化活性较弱。

谷胱甘肽是一种特殊的氨基酸衍生物，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸形成的三肽化合物，分为还原型谷胱甘肽（GSH） 及氧化型谷胱甘肽（GSSH）两类[17]。还原型谷胱甘肽具有保护肝细胞膜、抗氧化、清除氧自由基、解毒等作用。试验以还原型谷胱甘肽为阳性对照，测得在相同浓度下，GSH 对DPPH 自由基的清除率可达到93.5%，而上述试验中筛选得到的具有较强抗氧化性的分子量＜5 kDa 的清蛋白酶解产物多肽对DPPH 自由基的清除率与其接近。

2.4 XPHs 对羟基自由基的清除能力

羟基自由基是氧化性最强的自由基，可和大部分生物大分子发生不同类型的反应，具有较高的速率常数，是危害最大的活性氧，因此研究清除·OH活性物质具有很重要意义。试验采用Fenton 反应体系来检测文冠果油粕分类蛋白肽清除·OH 的效果，其原理是H2O2的量和Fenton 反应产生的羟基自由基成正比，当给予电子受体后，用griess 试剂显色，形成红色物质，其呈色与·OH 的多少成正比关系[18]。

XPHs 对·OH 的清除率见图3。

由图3 可知，文冠果油粕分类蛋白酶解产物具有抗氧化活性，清除·OH 的能力按从大到小排列依次为XGLPH-II＞XGLPH-II＞XPPH-I＞XAPH-II＞XG PH-I＞XGPH-II＞XAPH-I＞XPPH-II。球蛋白和清蛋白的酶解产物多肽分子量＜5 kDa 的抗氧化能力高于分子量5～10 kDa 的抗氧化能力，而醇溶蛋白和谷蛋白的酶解产物多肽分子量＜5 kDa 的抗氧化能力低于分子量5～10 kDa 的抗氧化能力；在同浓度条件下，分子量小于5 kDa 的球蛋白酶解产物多肽对·OH 的清除率最高，可达75.00%。醇溶蛋白、谷蛋白、球蛋白的酶解产物多肽分子量＜5 kDa 对·OH 的清除能力相近，清除率为60%～65%。醇溶蛋白酶解产物多肽分子量＜5 kDa 和清蛋白酶解产物多肽分子量5～10 kDa 对·OH 的清除率最低，约为30%。综上所述，就清除羟自由基能力这一评价标准而言，文冠果油粕分类蛋白肽中分子量＜5 kDa 的球蛋白酶解产物多肽具有较高的抗氧化活性。

试验以还原型谷胱甘肽GSH 为阳性对照，测得在相同浓度下，GSH 对·OH 的清除率可达到90.0%，而上述试验中筛选得到的具有较强抗氧化性的分子量＜5 kDa 的球蛋白酶解产物多肽对·OH 的清除率达到75%。

2.5 Sephadex G-25 凝胶层析分离

由上述试验得出，文冠果油粕蛋白酶解产物多肽中分子量＜5 kDa 的清蛋白多肽和球蛋白多肽都具有较强的清除自由基的能力，其中清蛋白多肽清除DPPH 自由基的能力较强，而球蛋白多肽倾向于清除羟自由基，并且球蛋白多肽对2 种自由基的清除能力差异较大，鉴于此，为以后进一步研究奠定基础，试验则以清蛋白酶解产物多肽为对象，对其进行凝胶层析分离。

分子量＜5 kDa 的球蛋白酶解产物的凝胶层析洗脱峰图见图4。

由图4 可知，XGLPH-II 经Sephadex G-25 凝胶层析分离得到3 个组分，分别在250，600，750 min开始出现明显的吸收峰，试验结果说明分子量＜5 kDa 的球蛋白酶解产物中存在分子量更小的肽段。张强[19]同样采用Sephadex G-25 对碱性蛋白酶水解玉米蛋白粉得到的产物进行纯化，得到3 个洗脱峰，但只有第二峰有很强的抗氧化活性，可以推断，试验通过凝胶层析得到的这3 个峰中存在具有较强抗氧化活性的肽段。因此，要进一步获得有抗氧化活性的目标肽段，需要进一步通过液相色谱等方法分离纯化，并通过抗氧化活性测定不断筛选。

3 结论

研究文冠果油粕4 种蛋白的分离工艺及其酶解产物的抗氧化活性。试验结果如下：文冠果油粕粗蛋白含量为37.45%，改良Osborne 法分级分离4 种蛋白，谷蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、清蛋白提取率依次为53.87%，3.88%，17.65%，3.88%，上述4 种蛋白酶解产物中的活性肽的抗氧化性与蛋白种类和相对分子量有关。在同浓度条件下，就对DPPH 自由基的清除能力而言，清蛋白酶解产物中相对分子量＜5 kDa 的组分对DPPH·的清除能力最强，达到64.81%，而球蛋白酶解产物相对分子量＜5 kDa 的组分对·OH 的清除能力最强，清除率可达75%。严群芳[20]分离得到的6 个大豆蛋白肽片段中，10 mg/mL SP4 对羟自由基的抑制率达80.13%，试验中1 mg/mL XGLPH-II 对·OH 的清除率达75%，但其所需浓度仅为上述大豆蛋白肽浓度的1/10；贾薇[21]测定质量浓度为8 mg/mL 大米肽对DPPH·的清除率约为80%，试验分离得到的XAPH-II 在其质量浓度为0.25 mg/mL 时，对DPPH·的清除率即可达64.81%。由此，文冠果油粕有望成为提取天然抗氧化肽的新一种植物资源。这将极大地扩大文冠果的开发利用范围，同时也为开发新的生物抗氧化剂提供了新方向。