樊成辉，张阳，姜华茂

锦州医科大学附属第一医院，辽宁锦州121000

膀胱癌发病率占最常见恶性肿瘤的第10位[1]。近年来，膀胱癌的治疗方法具有多样性，包括经尿道膀胱肿瘤电切术、根治性膀胱切除术、化疗、免疫疗法[2]。目前，国内外膀胱癌的主要治疗方法是手术联合膀胱内化疗，经尿道膀胱肿瘤切除(TURBT)是多数膀胱癌的首选治疗方法，但TURBT对术者的要求高，且手术治疗后患者复发率和远处转移率均较高[3]。为降低肿瘤复发率，临床常在手术切除肿瘤的同时联合应用化疗，不良反应较大[4]。目前，中药在肿瘤治疗中的药用价值[5]已成为目前的研究热点。异土木香内酯主要来源于菊科植物土木香的根部，可促进多种恶性肿瘤的细胞凋亡。但是关于异土木香内酯对膀胱癌凋亡的影响相关研究甚少。2019年3月～2020年2月，我们体外培养人膀胱癌细胞株T24，观察异土木香内酯对T24细胞增殖、凋亡的影响，并探讨其可能作用机制。现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 细胞、材料和仪器 T24细胞购自上海富衡公司；培养在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，37 ℃，湿度、5% CO2培养箱中培养，隔天换液，待细胞融合度80%～90%时0.25%胰蛋白酶消化，每2～3天细胞传代。异土木香内酯(纯度>98%)购自北京索莱宝公司，按照说明书，使用DMSO溶解异土木香内酯配制成终浓度为80 nmol/L的母溶液，使用时稀释相应浓度，DMSO终浓度<0.1%。N-乙酰半胱氨酸(NAC，一种抗氧化剂)购自美国Sigma公司，将NAC粉末溶解于双蒸水中，配置成1 mol/L的溶液，使用时培养基稀释成5 nmol/L，母溶液均过滤除菌后-20 ℃保存备用。JC-1线粒体膜电位检测试剂盒、二甲基亚砜(DMSO)、PBS溶液购自北京索莱宝公司；0.25%胰蛋白酶购自美国Sigma公司；RPMI-1640培养基购自美国Corning公司；CCK-8试剂盒、Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒购自日本同仁公司；活性氧检测试剂盒购自上海碧云天公司。兔多克隆Bax、Bcl-2、Cytochrome C、 Caspase-3抗体购自美国CST公司；鼠单克隆β-Actin抗体购自美国Sigma；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和山羊抗鼠二抗购自北京博奥森公司；多功能酶标仪购自瑞士Tecan公司；低温高速离心机购自美国Thermo公司；电泳仪购自美国Bio-Rad公司；流式细胞仪购自美国BD公司；凝胶成像仪购自美国GE公司。

1.2 加入异土木香内酯培养的T24细胞增殖情况观察 采用CCK-8法。取对数生长期T24细胞，调整细胞密度1×105/mL，将其接种于96孔板，每孔100 μL细胞悬液。待细胞贴壁后，将细胞分为1、2、3、4、5、6组，1、2、3、4、5组(实验组)分别加入5、10、20、40、80 μmol/L的异土木香内酯，6组加入正常培养液(对照)，分别于培养24、48、72 h时，取各组细胞， 吸弃旧培养基，每孔加入含10 μL的CCK-8试剂培养基100 μL，2 h后用酶标仪检测各孔450 nm处光密度(OD)值，测算各组细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=[1-(实验组OD值-空白孔OD值)/(对照组OD值-空白孔OD值)]×100%。重复3次，取平均值。根据增殖抑制率进一步测算出异土木香内酯作用24 h时T24细胞的半数抑制浓度(IC50)为22.45 μmol/L，并将其用于后续实验。

1.3 加入异土木香内酯培养的T24细胞凋亡情况观察 采用流式细胞术。取对数生长期T24细胞，1×105/mL接种于6孔板中，待细胞贴壁后，将细胞分为A组(对照)、B组(5 nmol/L NAC)、C组(10 μmol/L异土木香内酯)、D组(20 μmol/L异土木香内酯)及E组(5 nmol/L NAC+20 μmol/L异土木香内酯)，每组6个复孔。A组加入不含异土木香内酯的培养液培养，B、E组先加入5 nmol/L的NAC预处理培养2 h，C、D、E组分别加入10、20、20 μmol/L的异土木香内酯，培养24 h。收集各组细胞，用不含EDTA的胰蛋白酶消化离心收集细胞，PBS离心清洗2次。制细胞悬液，分别加入5 μL Annexin V-FITC结合物和5 μL的PI Solution，室温下避光培养15 min。加入400 μL 1×Annexin V Binding Solution，1 h内流式细胞仪完成检测，测算各组细胞凋亡率。重复3次，取平均值。

1.4 加入异土木香内酯培养的T24细胞活性氧簇(ROS)检测 采用流式细胞术。参照“1.3”对细胞进行分组处理。制细胞悬液，加入500 μL预先稀释的 DCFH-DA 荧光探针 37 ℃染色 ，避光孵育30 min，PBS洗2次后，采用流式细胞仪检测各组细胞ROS含量水平，其平均荧光强度可间接反映ROS含量。荧光强度越高,反映ROS含量越多。重复3次，取平均值。

1.5 加入异土木香内酯培养的T24细胞线粒体膜电位检测 采用JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位。参照“1.3”对细胞进行分组处理。制细胞悬液，加入1 mL细胞培养液和1 mL的JC-1染色液充分混匀，37 ℃培养箱中孵育25 min，室温下离心收集细胞，用JC-1 染色缓冲液(1×)清洗2次，吸取500 μL JC-1 染色缓冲液(1×)重悬细胞，采用流式细胞仪检测线粒体膜电位。JC-1荧光探针检测细胞线粒体膜电位，JC-1 聚集在线粒体基质内,形成聚合物为红色荧光，即线粒体膜电位较高；JC-1不能形成聚合物而形成单体时为绿色荧光，即线粒体膜电位较低，计算JC-1绿色荧光单体所占百分比(间接反映线粒体膜电位变化),绿色荧光单体越多，反映线粒体膜电位越低。重复3次，取平均值。

1.6 加入异土木香内酯培养的T24细胞相关凋亡蛋白Bax、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、细胞色素C(Cytochrome C)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)检测 采用Western blotting法。取对数生长期T24细胞分为4组，每组6个复孔，其中3组分别加入10、20、40 μmol/L异土木香内酯，另外1组加入不含异土木香内酯的培养液处理(对照组)，培养24 h时收集各组细胞，加入 0.1 mL 含有蛋白酶抑制剂的RIPA 细胞裂解液在冰上裂解30 min，低温高速离心机中离心，取上清液，用BCA法测定总蛋白浓度，利用酶标仪测定吸光度值制定标准曲线，根据结果制样。进行SDS-PAGE 电泳分离,冰浴下将蛋白质转移至 PVDF 膜上,采用 5%脱脂奶粉封闭 1 h, 兔多克隆Bax、Bcl-2、Cytochrome C、 Caspase-3一抗(1:1 000稀释)鼠单克隆β-Actin一抗(1∶10 000稀释) 4 ℃孵育过夜,次日TBST清洗3次，二抗(1∶10 000稀释) 孵育2 h，ECL采用化学发光显影，通过凝胶成像检测各组Bax、Bcl-2、Cytochrome C、Caspase-3蛋白。重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 不同培养时间各组细胞增殖抑制率比较 培养24、48、72 h时各组细胞增殖抑制率比较见表1。

表1 培养24、48、72 h时各组细胞增殖抑制率比较

2.2 各组细胞凋亡率比较 培养24 h时A、B、C、D、E组细胞凋亡率分别为6.59%±1.22%、8.53%±1.015、20.72%±2.11%、43.21%±2.20%、8.32%±2.78%,与A组比较，C、D组细胞凋亡率升高(P<0.05)；与C组比较,D组细胞凋亡率升高(P<0.05);与D组比较，E组细胞凋亡率降低(P<0.05)。

2.3 各组细胞ROS含量比较 培养24 h时A、B、C、D、E组细胞ROS荧光强度分别为997±236、1 699±315、4 609±548、10 026±605、1 831±307，与A组比较，C、D组细胞ROS含量升高(P<0.05)；与C组比较,D组细胞ROS含量升高(P<0.05)；与D组比较，E组细胞ROS含量降低(P<0.05)。

2.4 各组细胞线粒体膜电位比较 培养24 h时A、B、C、D、E组细胞线粒体中绿色荧光单体百分比分别为11.30%±1.32%、12.34%±1.66%、27.19%±1.19%、52.61%±2.11%、21.94%±1.02%，与A组比较，C组细胞线粒体膜电位降低(P<0.05)；与C组比较,D组细胞线粒体膜电位降低(P<0.05);与D组比较，E组细胞线粒体膜电位升高(P<0.05)。

2.5 各组细胞Bax、 Bcl-2、Cytochrome C、Caspase-3相对表达量比较 各组细胞Bax、Bcl-2、Cytochrome C、Caspase-3相对表达量比较见表2。

表2 各组细胞Bax、Bcl-2、Cytochrome C、Caspase-3相对表达量比较

3 讨论

膀胱肿瘤是泌尿系统疾病发病率较高的恶性肿瘤之一，每年估计有549 000例新发病例(占癌症新发病例3%)和200 000例死亡病例(占癌症死亡人数2%)。膀胱癌在男性中更为常见，其发病率和病死率分别为9.6/10万和3.2/10万，约是女性的4倍。膀胱癌的发病原因相当复杂，除了某些接触化学和水污染的职业外，吸烟是膀胱癌发病的主要危险因素之一[6]。

植物用于癌症治疗的历史悠久，已经有3 000多种植物用于治疗癌症，人们不断研究大自然中各种生物形式的提取物以寻找抗癌化合物[7]。研究膀胱癌分子靶点治疗药物仍然是当前一大热点。异土木香内酯属倍半萜内酯类化合物，提取自菊科旋覆花属植物土木香的根部，具有广泛的药理学作用，作为治疗癌症的药物具有巨大的潜力[8]。异土木香内酯药理学研究表明具有驱虫、抗菌、抗真菌、抗肿瘤、抗炎、抗损伤、降血糖、止痛、保护神经等效果[9，10]。在此,我们主要研究异土木香内酯诱导T24细胞增殖、凋亡的初步机制。

细胞的增殖和细胞凋亡的相对稳定对维持人体功能非常重要。因此,诱导细胞增殖和细胞凋亡机制相关研究已成为了抗肿瘤研究的热点。线粒体是真核细胞生物进行氧化代谢的细胞器,不仅为各种细胞的生命活动提供能量,而且参与了多种生物学过程，在能量代谢过程中线粒体产生的内源性ROS可作为信号转导分子在信号传导和体内稳态中具有重要作用[11]。ROS通常被认为是氧消耗和细胞代谢的副产品，主要由正常细胞中的线粒体氧代谢产生，是参与维持细胞内环境的重要分子，包括超氧基(O2·)、羟自由基(OH)、过氧化氢(H2O2)、单氧分子等[12]。一定情况下，细胞内ROS含量能够体现氧化还原的程度，从而决定细胞的存活，在低浓度下，ROS诱导正常细胞和癌细胞增殖以及存活, 在中等浓度时，ROS可以诱导暂时或永久的细胞周期阻滞并促进细胞分化, 然而，在较高浓度下，ROS会破坏蛋白质、DNA、RNA等细胞生物分子，并导致突变从而促进正常细胞或癌细胞凋亡[13]。ROS还可以作为激活线粒体途径的信号通路的第二信使，可以激活线粒体内级联反应中蛋白Bcl-2家族，Bcl-2家族成员包括促凋亡蛋白因子Bax和抗凋亡蛋白因Bcl-2因子[14]。ROS通过下调线粒体外膜的Bcl-2家族蛋白表达，促使促凋亡因子Bax转位到线粒体上，引起线粒体膜过氧化破坏,诱导细胞内线粒体膜电位下降,启动线粒体途径的凋亡过程，诱导Cytochrome C的大量释放进入胞质中，活化Caspase蛋白酶家族,引起细胞凋亡的级联反应,使细胞进入不可逆的凋亡过程[15，16]。本研究发现，随异土木香内酯药物浓度增加，细胞增殖抑制明显，细胞凋亡率升高，细胞内ROS含量显著增加，JC-1绿色荧光单体的荧光强度增强。应用ROS清除剂NAC后，可以减弱异土木香内酯对人膀胱癌T24细胞凋亡率、细胞内ROS含量、线粒体膜电位的影响。说明了异土木香内酯在引起T24细胞ROS的大量积聚后,ROS引起了线粒体膜的过氧化破坏,导致细胞凋亡率上升，细胞内线粒体膜电位下降,启动了细胞线粒体途径的凋亡过程。 蛋白印迹实验结果表明异土木香内酯能上调Bax、Cytochrome C、Caspase-3相对表达量，下调Bcl-2相对表达量，从而发挥其抗癌作用。

综上所述,异土木香内酯可抑制T24细胞增殖，促进细胞凋亡，其机制可能为异土木香内酯作用T24细胞后，提高细胞内ROS的产生,降低细胞线粒体膜电位，促进Bax、Cytochrome C、Caspase-3表达。异土木香内酯对其肿瘤的作用机制及其在人体内的药理作用有待进一步研究,有望开、作用发成为以线粒体凋亡途径为靶点的新型抗肿瘤药。