顾佶丽，何涛，魏瑞成，王冉*

(1.南京农业大学动物科技学院，江苏 南京 210095；2.江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所/省部共建重点实验室—江苏省食品安全重点实验室，江苏 南京 210014)

抗生素在对抗细菌感染性疾病的过程中发挥了巨大作用，然而随着抗生素的广泛使用甚至滥用，细菌对其产生了耐药性。与细菌本身具有的天然耐药性不同[1]，这种耐药性是通过染色体的突变，或者整合外源的抗生素耐药基因(ARGs)获得的，也叫做获得性耐药[2]。ARGs的水平转移可以通过三种机制实现：转化(transformation)、接合转移(conjugation)以及转导(transduction)。其中接合转移和转导都需要借助于可移动遗传元件(mobile genetic elements,MGEs)实现。根据其行为特征可以将介导耐药性水平转移的MGEs分为两种主要类型：一类是可以在细菌宿主染色体外独立进行复制并传播的,这一类最经典的代表就是质粒(plasmid)，也是目前最受关注的MGEs，它在细菌耐药性的水平转移和扩散中发挥了巨大作用,另外一类MGEs则需要整合到宿主基因组DNA上以维持其稳定存在，包括整合子、插入序列、转座子、基因岛、整合性接合转移元件(ICEs)以及噬菌体等。质粒、整合子和基因岛等MGEs在耐药基因传播过程中的重要性已经得到了人们的广泛认识，而对于噬菌体在耐药基因转移和扩散中的贡献关注较少。因此，本文主要对噬菌体在耐药性传播中的作用及其分子机制进行综述。

1 噬菌体的定义及类型

噬菌体是一种感染细菌的病毒，英文名称为“bacteriophage”，简称“phage”，意思是“吃细菌的病毒”。它们的基因组DNA或RNA被包裹在蛋白成分的衣壳(capsid)内部，因能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。它在自然界的数量庞大，存在于细菌的各个生存环境中[3-5]，如海洋、淡水、土壤、植物叶层和根围、动物养殖环境、受人类活动影响的环境(如污水处理厂)以及人类肠道，甚至是极端环境中(表1)。从数量来说，自然界中噬菌体的总数估计超过了1030甚至1032，尤其以海洋中最为丰富。噬菌体可以分为裂解性(lytic)和温和性(temperate)两种：裂解性噬菌体可以特异性地感染某些细菌，利用细菌宿主合成自身的DNA以及蛋白进行包装后形成子代噬菌体，最后细菌宿主被裂解而子代噬菌体释放出来。温和性噬菌体，也叫溶原性(lysogenic)噬菌体，大多情况下其DNA整合到宿主的染色体DNA上，这个过程也叫溶原转换，随着宿主DNA的复制一起进行复制，而噬菌体中对细菌有害的基因不会表达，这种整合到宿主染色体上的噬菌体也叫做前噬菌体(prophage)，携带前噬菌体的细菌叫做溶原菌(lysogen)。有部分前噬菌体，如P1、N15，LE1，φ20和 φBB-1，并不整合到宿主染色体上而以环状或线性的质粒形式存在于宿主细胞内。能够发生溶原转换的噬菌体一般可以编码转录抑制因子和整合酶等基因。在某些环境压力(紫外线、抗生素压力等)条件下发生溶原的前噬菌体可以从细菌宿主中释放出来，这个过程叫做诱导(induction)，此时噬菌体进入裂解期，宿主菌裂解死亡而子代噬菌体释放出来。但是如果前噬菌体中涉及溶原-裂解转换功能的基因或是某些表达结构蛋白的基因丢失，从而造成前噬菌体不能从宿主菌中诱导出来，这种不可诱导前噬菌体的DNA序列会长期存在于细菌基因组中。细菌基因组中的前噬菌体是否具有完整的功能活性，可以通过在线预测软件Prophage Hunter(https://pro-hunter.bgi.com/)和PHAST(http://phast.wishartlab.com/)进行预测。

表1 环境中噬菌体的丰度

2 前噬菌体及其分布

目前除了一些在实验室偶然发现的经典前噬菌体外(λ，P1,P2,P4,P22,N15)，系统性研究表明前噬菌体在细菌中广泛存在，这些前噬菌体有些具有功能活性，可以被诱导出来。如75%的化脓性链球菌中携带至少一个前噬菌体；Osawa等[6]从51株致病性大肠杆菌中发现了27个不同的携带志贺氏菌毒素的前噬菌体；Schicklmaier等[7-8]发现107株大肠杆菌中有83株可以诱导出至少一个前噬菌体，173株沙门氏菌中有136株可以释放出前噬菌体，而实验室常用的沙门氏菌LT2携带了4个完整的、具有功能的前噬菌体；有研究表明使用米诺环素C可以从170个耶尔森菌属中诱导出7个具有功能的前噬菌体，以及从68个革兰氏阳性奶牛源链球菌中诱导出38个前噬菌体或噬菌体样颗粒。另有研究表明利用探针杂交的方法可以在同一种属的多株细菌中检测到同一特定的前噬菌体。据统计，某些细菌中前噬菌体基因组(包括完整和不完整)的含量可以高达10%～20%，不同细菌种属含有的前噬菌体数量也不相同，如金黄色葡萄球菌基因组中大概有1～4个前噬菌体，某些大肠杆菌中前噬菌体的数量达到了20个。细菌基因组中前噬菌体普遍存在，这些前噬菌体极大地丰富了细菌的基因组内容，对细菌基因组的多样性和细菌的进化发挥了重要作用，其中就包括细菌耐药基因的获得和传播，从而使其适应外界复杂的生存环境。

3 噬菌体在耐药性传播中的作用

早在19世纪50年代，就发现噬菌体可以转移细菌(主要是大肠杆菌和沙门菌)染色体或质粒上的ARGs，这个过程称为转导(transduction)。相对于介导ARGs转移的其它方式(质粒、整合子、转座子等)，转导发生的频率相对较低，且不同细菌种属差异较大，如在金黄色葡萄球菌和链球菌中转导频率达到10-5～10-6，而在大肠杆菌、沙门菌等革兰阴性菌中转导频率则为10-5～10-10，而质粒等移动元件的转移频率可以达到10-1～10-3，因此由噬菌体转导方式介导的ARGs水平转移受到的关注较少。尽管如此，由于噬菌体结构简单，容易在环境中长期存活并可以对抗各种(DNA酶、温度和辐射)环境压力[9]，因此，它可以作为自然环境中耐药基因转移的最合适载体；并且环境中噬菌体数量巨大，不需要借助细菌与细菌之间的接触就可以传递遗传物质，因此转导在自然界中可能随时随地发生，其在耐药性传播中的作用远远超出我们的想象。噬菌体不仅可以和ARGs共存于同一生态环境和同一细菌中，并且通过体外实验证明了某些ARGs可以通过噬菌体在同一种属细菌甚至不同种属细菌之间传递。

3.1 噬菌体与耐药基因的共存现象

目前在多种细菌的前噬菌体中发现了抗生素耐药基因(表2)：如在大肠杆菌和沙门菌中发现了P1-like噬菌体并分别携带了blaSHV-2和blaCTX-M-27β-内酰胺酶基因[2,10]；在猪源大肠杆菌和人医临床肺炎克雷伯菌中发现P7-like噬菌体并携带了多黏菌素耐药基因mcr-1[11-12]；在西班牙某医院分离到的多个肠杆菌科细菌中发现超广谱β-内酰胺酶基因blaCTX-M-10与噬菌体遗传元件存在偶联关系[13]；化脓性链球菌中的大环内酯类耐药基因mefA位于58.8 kb的转座子上，该转座子插入到了该菌的前噬菌体中[14]；携带四环素耐药基因tet(M)的Tn916-like转座子元件在肺炎链球菌的前噬菌体中被发现[15]；炭疽杆菌前噬菌体中携带了对磷霉素耐药的基因[16]。随着宏基因组测序和实时荧光定量PCR(qPCR)技术的发展，ARG被发现存在于多种环境来源的噬菌体DNA上，包括活性污泥、城市污水和河流、医院废水、污水处理厂废水以及土壤中，如有学者使用了qPCR的方法检测了城市污水和河水样本中噬菌体DNA中的耐药基因，结果检测到了两种β-内酰胺酶耐药基因(blaTEM和blaCTX-M)以及青霉素结合蛋白基因mecA[17]；另有研究表明医院和城市废水中的噬菌体DNA中含有高水平的β-内酰胺酶基因(blaTEM,blaCTX-M和blaSHV)和喹诺酮类耐药基因(qnrA,qnrB和qnrS)[18]；最近的一个研究证明了被粪便污染的水体中分离的噬菌体DNA含有喹诺酮耐药基因qnrA和qnrS，并且对水体进行螯合剂(EDTA或枸橼酸钠)的处理可明显增加噬菌体DNA中耐药基因的数量[19]；Muniesa等[20]在城市污水中发现了携带blaOXA-2,blaPSE-1、blaPSE-4以及blaPSE-type基因的病毒颗粒；除了生活环境，在人类的肠道、肺部的病毒组中也检测出了多个抗生素耐药基因。本实验室收集了NCBI数据库上发表的8 263个完整的噬菌体基因组序列，通过深入分析发现有20个(0.24%)噬菌体携带了β-内酰胺类耐药基因，间接说明了噬菌体可能在耐药基因的传播过程中发挥作用。

表2 噬菌体中存在的耐药基因

3.2 噬菌体介导的耐药基因转移证据

与质粒、整合子、转座子、基因岛和ICEs不同，噬菌体不需要细菌之间接触就可以传递遗传物质。目前已有多篇噬菌体转移耐药基因的文献报道，噬菌体在转移耐药基因进入受体菌的同时，赋予受体菌相应的耐药表型(表3)。噬菌体转导耐药性可以在同种属细菌的不同菌株之间进行，如P22及P22-like噬菌体可以介导耐药基因簇在鼠伤寒沙门菌DT104菌株之间转移[8,21]。四环素耐药基因和氯霉素-大环内酯类-林可霉素-克林霉素耐药基因可以通过溶原性噬菌体在临床化脓性链球菌菌株间水平转移[22]。亚胺培南、头孢他啶和氨曲南耐药基因可以通过溶原性噬菌体转移至铜绿假单胞菌临床株[23-24]。ΦC2 可介导编码红霉素耐药基因erm(B)的转座子Tn6215在艰难梭菌之间传播[25]。温和性噬菌体Aa phi ST1可介导四环素耐药转座子Tn916在放线杆菌之间传递[26]。耐药性转导在葡萄球菌尤其是金黄色葡萄球菌中比较普遍，如金葡菌前噬菌体φ11，φ80 和 φ80α可对携带mecA基因的I型SCCmec遗传元件进行包装，从而能够在不同金葡菌之间转移mecA基因[27]；噬菌体φ80α等不仅可介导青霉素和四环素耐药基因向金黄色葡萄球菌流行株USA300传播，还可以介导耐药基因向噬菌体不敏感的金葡菌转移[28-29]。噬菌体介导耐药基因转移不仅可以在同种属细菌之间发生，还可以在不同属细菌之间进行，如P1及P1-like噬菌体可以介导耐药基因或耐药质粒在大肠杆菌之间或大肠杆菌与猪霍乱沙门氏菌之间进行转移[21,30-31]；四环素耐药性可以通过溶原性噬菌体从猪源鸡肠球菌转移至粪肠球菌，庆大霉素耐药性也可以通过溶原性噬菌体从猪源粪肠球菌转移至屎肠球菌、希氏/坚韧肠球菌和酪黄肠球菌中[32]。噬菌体φOT8可介导耐药质粒在沙雷菌之间或沙雷氏菌和成团泛菌之间进行传播[33]；噬菌体Φm46.1可以介导耐药基因mef(A)和tet(O)从化脓性链球菌向无乳链球菌和戈登链球菌转移[34];噬菌体φ879可介导四环素和氨基糖苷类耐药质粒在松鼠葡萄球菌之间以及从松鼠葡萄球菌向金黄色葡萄球菌转移[35]；金葡菌前噬菌体可以介导链霉素耐药基因以高频率在金黄色葡萄球菌之间或从金葡菌向单增李斯特菌传播[27]。

表3 噬菌体转导的耐药基因

3.3 噬菌体转移耐药基因的分子机制

噬菌体转移耐药基因是通过转导方式进行的，目前有三种转导方式：特异性转导(specialized transduction)、普遍性转导(generalized transduction)和侧向转导(lateral transduction)。

特异性转导又称为局限性转导，这种转导方式只能转移特定的基因片段到受体菌中，目前发现只能由温和性噬菌体介导。发生特异性转导的噬菌体一般整合到宿主菌的特定位点，在裂解宿主菌的过程中，噬菌体将整合位点附近的宿主DNA包装进自己的衣壳颗粒中，这种包装错误的噬菌体感染受体菌并将外源DNA整合到受体菌染色体上，此时特异性转导发生。一般来说，那些能够通过“cos”机制切割和包装DNA，产生单位长度衣壳化DNA分子的噬菌体(如λ，T7)负责特异性转导，在该转导过程中，宿主的基因组DNA和噬菌体DNA是共价地结合在一起的，与噬菌体DNA一起进行复制、包装和导入到受体细菌中。由于细菌基因组上与“cos”位点同源的序列很少，因此，特异性转导只能转移特定的细菌基因组片段到受体菌中，所以该转导方式发生的频率较低。

普遍性转导能转移细菌基因组的任何DNA片段到受体细菌中，即转移的宿主基因具有随机性，一般通过温和性噬菌体介导，但也有报道表明经过突变的裂解性噬菌体T4也可发生普遍性转导。噬菌体感染宿主菌后，可以产生两种类型的子代病毒颗粒，一种为只包含噬菌体DNA的颗粒，一种为错误包装宿主DNA片段的颗粒，也叫做转导颗粒(transducing particles)。这些转导颗粒除了衣壳蛋白是来源于噬菌体的，其包装的DNA全部来自细菌基因组，因此，其携带外源DNA的容量较大。转导颗粒如果成功感染某些细菌，可以将其中包装的DNA片段带入受体菌中，受体菌通过重组机制将外源基因整合到自身的染色体上，此时普遍性转导完成。另有一种情况是被包装的DNA片段是质粒，该质粒通过转导进入受体菌中会发生环状化，形成环状的质粒，因此普遍性转导除了可以转移基因片段外，还可以水平转移耐药质粒。发生普遍性转导的噬菌体通过满头(headful)包装机制包装基因组，一般这些噬菌体(如P1、P22、T4)在特异性位点(pac位点)切割自己的基因组并最大能力地包裹它们的DNA到噬菌体衣壳中。一般细菌基因组中具有多个与pac同源的位点,一旦这些pac同源位点被噬菌体“错误”识别并切割，就有可能将细菌DNA包装在噬菌体衣壳中，形成可转导噬菌体颗粒。外源基因能否在受体菌中稳定存在取决于该DNA序列整合到细菌基因组中的能力，即发生重组(同源重组、异常重组和位点特异性重组)的几率，而这些是由前噬菌体中携带的重组酶、整合酶或者外源基因上存在的转座酶或拓补异构酶等因素共同决定的。普遍性转导还有一种情况，它不仅可以使携带前噬菌体的溶原菌获得竞争者的基因片段，同时可以杀死竞争者，从而有利于自身克隆的增殖，这种机制叫做自我转导(auto-transduction)，有研究表明该机制可以增加金葡菌获得耐药基因的几率[33]。

Chen等[37]最新研究发现金黄色葡萄球菌温和噬菌体参与了一种特殊的转导形式：侧向转导，在该过程中葡萄球菌前噬菌体不遵循经典的切除-复制-包装途径，而是噬菌体的切除过程往后延迟，在复制和包装过程后进行。细菌基因组上的前噬菌体通过原位的DNA复制，可以产生多个前噬菌体基因组拷贝，随后噬菌体在包装DNA的过程中，可以同时形成成熟的噬菌体以及具有转导能力的噬菌体颗粒，因此极大地提高了转导效率，该方式可以将金黄色葡萄球菌基因组中上百kb大小的片段以非常高的频率包装在噬菌体的头部，因此被认为是一种最有效的转移耐药基因的方式，该种转导方式目前仅在金黄色葡萄球菌中报道。

在以上三种转导方式中，普遍性转导是最主要的方式，它发生的频率在10-5～10-10之间，有时高达10-1(表3)。这种转导方式可以在同一种属细菌的不同菌株中发生，也可以在不同细菌种属中发生，因此普遍性转导在耐药基因的跨种属传播中发挥了重要作用。特异性转导转移耐药基因的机率很小，主要原因是噬菌体的整合位点主要位于细菌的核心基因组(core genome)上，而耐药基因一般位于细菌基因组的可变区域(accessory genome)，同时特异性转导发生的频率较低(<10-9)，因此该种转导方式对耐药基因转移的影响可以忽略。值得注意的是，在金黄色葡萄球菌中，特异性转导方式在其染色体基因岛(PICIs)的转移过程中作用较大，而PICIs可同时携带毒力基因和多种耐药基因(如β-内酰胺酶、氨基糖苷类、磷霉素、夫西地酸等耐药基因)，因此普遍性转导和特异性转导方式均对金葡菌耐药性的获得和传播发挥重要作用。侧向转导转移基因片段的大小和效率最高，因此被认为是最有效的转移耐药基因的方式，但是由于其仅在金黄色葡萄球菌中发现和报道，该种方式在其它种属细菌中转移耐药基因的潜力还有待进一步研究才能明确。对于转导来说，噬菌体宿主谱是一个影响耐药基因在细菌之间传播的主要限制因素，这是由噬菌体尾丝蛋白识别细菌宿主的特异性决定的。由于革兰阳性菌噬菌体的宿主谱相对广泛，因此推测噬菌体对耐药基因在革兰阳性菌中的传播作用要大于革兰氏阴性细菌。

3.4 噬菌体对肠道菌群的影响

噬菌体作为细菌的“自然天敌”，具有来源广泛、杀菌特异性强、杀菌效果好的优点，因此在细菌感染尤其是耐药菌的感染治疗中具有巨大应用潜力。前面所述噬菌体介导的耐药性转移和传播作用主要是由温和性噬菌体介导的，因此裂解性噬菌体在耐药菌的生物防控中仍具有应用价值。尽管如此，仍需要系统考察噬菌体在应用过程中，尤其是在肠道疾病治疗过程中可能对肠道菌群产生的影响。已有研究表明裂解性噬菌体通过作用于靶细菌，可波及到菌群中的其它非靶细菌成员及其代谢产物，从而对菌群造成广泛影响[38]。同时，肠道细菌中具有和人类健康相关的噬菌体组(gut phageome)，这些噬菌体组对于肠道菌群稳态的维持及耐药基因肠道内传播的贡献如何，也是下一步需要研究的方向。

4 结论

噬菌体是自然界中数量极为丰富的生物体，它存在于细菌生存的各个生态环境，对细菌基因组的多样性和进化发挥了重要作用。噬菌体结构简单，容易在环境中长期存活并可以对抗各种环境压力，因此它是耐药基因转移的最合适载体，对于耐药基因的传播和持留具有重要作用。同时，噬菌体不仅可以介导耐药基因在同一种属细菌之间传播，还可以介导耐药基因的跨细菌种属传播。因此，噬菌体在细菌耐药性的发展过程中发挥了重要作用。在上述研究基础上，今后对于噬菌体/耐药性关系可加强以下几个方面的研究工作：从体内外探究噬菌体转导耐药基因的驱动因素及其作用机制，如抗生素压力、炎症等因素；比较不同类型(温和性和裂解性)噬菌体在耐药性转移中的贡献，从而充分评估裂解性噬菌体在治疗中的安全性；深入研究噬菌体介导环境源耐药基因转移进入动物/人类共生菌以及致病菌过程中发挥的作用；建立科学的耐药基因传播扩散评估模型，充分考察噬菌体、质粒等可转移元件在耐药基因转移中的贡献。