黄天卓，丁薇娜，张琳杰，郑浩然，何鑫磊

(美伦医药集团有限公司，天津 300403)

肾茶(Clerodendranthus spicatus (Thunb.) C. Y. Wu)又称猫须草、猫须公、肾草，是唇形科，肾茶属多年生草本植物。肾茶具有抗炎镇痛、抗菌、抗氧化、利尿的作用，其还对肝脏肾脏有一定的保护作用[1]。临床上肾茶常在国内被用来治疗慢性肾炎、膀胱炎、尿路结石等，在国外也被用来治疗糖尿病、高血压，其含有黄酮类、酚酸类、木脂素类、二萜类、三萜类、色原烯类、甾体类、糖苷类和香豆素类等，其中熊果酸具有良好的抗炎作用[2]。近年来的研究发现熊果酸还具有抗癌的效果，因此其商业价值非常高[3]。肾茶提取物中化学成分复杂，目前很多熊果酸的HPLC检测方法测得的肾茶醇提液中熊果酸的峰形并不符合《中国药典》的要求，为了进一步利用肾茶提取物开发药物制剂及建立质量标准，美伦医药集团有限公司研发部利用HPLC法建立了能较好分离肾茶提取物中熊果酸的分析方法并对其进行了方法学考察研究。

1 实验仪器与试剂

1.1 仪器

1.2 试剂

乙腈186340(ThermoFisher Scientific)、娃哈哈矿泉水20181003(沈阳娃哈哈饮料有限公司)、磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)、四氢呋喃20181201(天津市大茂化学试剂厂)、熊果酸对照品110742-201915(中国药品检定研究院)、肾茶醇提液(美伦医药研发部提供)。

2 实验方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品的制备

由美伦医药集团有限公司药品研究院提供。

2.1.2 对照品的制备

精密称量熊果酸对照品2.90 mg(94.7%)，用10 mL甲醇溶解，定容到10 mL容量瓶中即得274.63 μg/mL熊果酸对照溶液。

2.1.3 流动相的制备

乙腈∶0.45 μm过滤后超声30 min、0.1%磷酸：取1 mL磷酸加入到1 L水中混匀，0.45 μm过滤后超声30 min、5%四氢呋喃∶取50 mL四氢呋喃加入到1 L水中，0.45 μm过滤后超声30 min、5%四氢呋喃(0.1%磷酸)∶取50 mL四氢呋喃加入到1 L 0.1%磷酸水中，0.45 μm过滤后超声30 min。

2.2 色谱条件

2.2.1 检测波长考察

宽甸县年最高气温整体呈周期性变化如图2所示。1989—1997年为一个变化周期，2000年最高气温为36.5℃，为历史最高；2006年最高气温为30.7℃，为历史最低；两者相差5.8℃。2009—2013年最高气温逐年降低，2015年最低气温为一个极低值，2016年最高气温开始回升。

液相设置波长范围为190～400 nm，对熊果酸全波长吸收检测，记录图谱。从图1可以看出熊果酸最大吸收波长在200 nm左右，固设置190、203、210 nm波长进行试验，图2、图3、图4显示203 nm波长下的熊果酸色谱峰符合要求并且吸收值最大。

图1 肾茶供试品3D吸收图

图2 波长190 nm下熊果酸对照色谱峰

图3 波长203 nm下熊果酸对照色谱峰

图4 波长210 nm下熊果酸对照色谱峰

2.2.2 流动相系统考察

分别使用五种不同配比流动相进行试验：①乙腈∶水=68∶32、②乙腈∶0.1%磷酸=68:32、③乙腈∶1%四氢呋喃(0.1%磷酸)=68∶32、③乙腈∶3%四氢呋喃(0.1%磷酸)=68∶32、③乙腈∶5%四氢呋喃(0.1%磷酸)=68∶32，结果见表1、图5。从结果看出分离度和拖尾因子均符合要求的只有③和⑤，为了增大以后检测的容错率，故选用⑤乙腈∶5%四氢呋喃(0.1%磷酸)=68∶32为熊果酸检测流动相。

表1 流动相系统考察

①乙腈∶水=68∶32、②乙腈∶0.1%磷酸=68∶32、③乙腈∶1%四氢呋喃(0.1%磷酸)=68∶32、③乙腈∶3%四氢呋喃(0.1%磷酸)=68∶32、③乙腈∶5%四氢呋喃(0.1%磷酸)=68∶32。

2.3 方法学考察

2.3.1 色谱条件

色谱柱：GL Science C18(4.6×250 mm，5 μm)、流动相为乙腈-5%四氢呋喃(0.1%磷酸)=68∶32，检测波长为203 nm；柱温：33℃；流速：1 mL/min；进样量：20 μL。

2.3.2 专属性

取肾茶醇提液、熊果酸对照品溶液、空白溶剂按2.3.1的条件进样分析，记录色谱图，结果见图6。结果显示空白溶剂不干扰检测，熊果酸能与临近峰分离度>1.5，拖尾因子在0.95～1.05。

图6 肾茶提取物专属性考察色谱图

2.3.3 线性

液相程序调整2.1.2中熊果酸对照品溶液进样量分别为2、4、6、8、10、12 μL，记录色谱图。根据表1分析得出回归方程为y=4401.2196x-14708.6，R=1.0000，表明该方法测得的熊果酸含量在54.926 ～329.556 μg是准确的。

表 2 肾茶供试品中熊果酸检测方法学考察-线性

2.3.4 耐用性

表3 耐用性(温度、流速、流动相组成)峰面积RSD%

图7 肾茶供试品中熊果酸检测方法学 考察色谱图-耐用性(温度)

图8 肾茶供试品中熊果酸检测方法学 考察色谱图-耐用性(流速)

除各考察项变动外，其余项均同2.3.1中色谱条件。①柱温：32、33、34℃；②流速：0.95、1.0、1.05 mL/min；③色谱柱型号：7F3719-07 wondaSil c18、6k3708-01 wondaSil c18、4DG71569 wondaCract OD；④流动相组成：乙腈-5%四氢呋喃(0.1%磷酸)=67∶33、68∶32、69∶31，结果见表3和图7～9。结果表明在柱温、流速、色谱柱或流动相组成发生微小变化时，熊果酸的峰面积基本保持一致，满足系统适用性要求。

图9 肾茶供试品中熊果酸检测方法学 考察色谱图-耐用性(流动相比例)

2.3.5 重复性

平行制备6份肾茶醇提液作为供试品，按2.3.1的条件进样，记录色谱图，结果见图10，并计算熊果酸含量和相对标准差RSD。重复性试验峰面积的RSD=0.980%<3%，符合要求，重复性良好。

图10 肾茶供试品中熊果酸检测方法学考察色谱图-重复性

2.3.6 准确度

取肾茶醇提液9份，每份2 mL，这9份供试液再分为三组，按其中熊果酸含量的0.5倍、1倍、1.5倍添加熊果酸对照品，混匀后过0.45 μm滤膜，按2.3.1中条件进样，记录谱图，根据重复性试验的结果计算各供试溶液中熊果酸含量，并计算回收率及其相对标准偏差RSD。准确度的试验结果在92%～105%范围内，回收率相对标准偏差RSD=2.04%，表明该法测熊果酸含量的结果与实际值较为接近，准确度较好。

表4 肾茶供试品中熊果酸检测方法学考察-准确度(加标回收率)

3 讨论

熊果酸是肾茶中起主要药理作用的化学物质之一，目前已有的制剂将其定为质量检测的标准物质，但该制剂上市时间早，检测方法薄层层析不够准确。试验发现采用目前已发表的文献中对熊果酸检测的方法进行试验[4-6]，均难以达到《中国药典2020》[7]中规定的分离度大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之间，因此建立肾茶中熊果酸的HPLC检测方法对肾茶新制剂的开发具有重要的研究指导意义。

本研究主要通过HPLC法建立肾茶中熊果酸的检测方法并进行方法学考察，为其鉴定和质量控制提供标准，该法检测到的熊果酸不仅能有较好的分离度，而且检验时间短，大大缩短了药品研发所需要的时间。参照《中国药典2020》，本研究分别对检测波长、专属性、耐用性、重复性和准确度进行考察，其结果均符合《中国药典2020》要求。

在多次研究探索过程中，发现添加四氢呋喃可以调整峰形，但其也有减少出峰时间的作用，因此不宜添加过多，以免造成分离度不够；四氢呋喃还可能腐蚀柱子或者液相里的某些零件，使用时应当注意器材是否会被四氢呋喃腐蚀；四氢呋喃容易被氧化，因此用之前需要检查试剂瓶中液体是否有分层现象。