周大虎，瞿子扬，聂丽云， 刘嘉龙，傅军如，唐文帮，贺浩华

(1.江西农业大学 农学院，作物生理生态与遗传育种教育部重点实验室，江西 南昌 330045； 2.湖南农业大学 农学院，南方粮油作物协同创新中心，湖南 长沙 410128)

氮素是植物体生长发育所必需的大量营养元素之一，同时也是植物体内核酸、蛋白质和叶绿素等许多重要物质的组成成分；另外，在植物生长过程中氮素供给直接限制作物生长发育和产量构成[1-2]。水稻是我国重要的粮食作物，为了保障粮食安全，先前氮肥的使用对水稻的产量发挥了重要作用。然而，近些年随着氮肥的过量施用，作物对氮肥吸收效率逐渐降低，不仅作物增产效果不再明显，土地也造成严重污染[3-4]。在水稻生产过程中，施氮量过高而利用率较低等已成为我国农业生产上的严重问题[5-6]。我国目前水稻平均施氮量高出世界水平的75%，过量施用氮肥不仅导致生产成本不断提高，收益越来越少，而且造成资源严重浪费，环境持续恶化，甚至降低了水稻的品质[7-8]。因此，针对氮高效利用和耐低氮水稻品种少以及筛选方法的多样性等问题，探索更加准确可靠的耐低氮和氮高效筛选方法来筛选耐低氮和氮高效利用的种质显得尤为重要，进而挖掘水稻氮高效利用和耐低氮有利基因并阐明其遗传机理，为培育耐低氮水稻新品种提供理论依据。

水稻种质资源丰富，不同水稻品种的耐低氮特性及氮素利用率各不相同。因此，许多研究者利用不同耐低氮和氮高效利用指标来筛选优异种质资源[9-11]。其中，有研究者把单株干物质作为苗期氮素效率高低的筛选指标[12]；还有研究者把叶绿素 SPAD 值作为氮高效水稻种质的筛选指标[13]。然而，钟代斌等[14]认为单一指标鉴定可能带来误差，因此，把地上部干物质量、苗期分蘖数和叶绿素含量 SPAD 值3个指标的相对耐性指数作为筛选指标[14]。同时，郑家奎等[15]把株高、有效穗数、结实率、单株产量和生物产量作为筛选综合指标，并指出5项指标均在90% 以上为耐低氮胁迫的水稻品种。除此之外，也有研究者结合育种实践，筛选大面积种植品种的耐低氮特性。张宁[16]认为采用与产量性状相关的多个次级指标进行筛选结果更加科学。朴钟泽等[17]建议把有效穗、高结实率和高收获指数作为筛选耐低氮水稻品种的参考指标。赵祥等[18]用耐低氮综合指数RITCM来评价水稻对低氮胁迫的耐受能力。李发桥等[19]根据相对产量(低氮条件下水稻产量/正常施氮条件下的产量)评价水稻品种的耐低氮能力。总之，前人一般采用直接鉴定与评价性状来进行比较，利用不同水稻品种依据耐低氮相关的生理生化及形态指标进行筛选，但尚未形成一套可靠、准确而实用的评价体系。

本研究结合前人的经验，以优质耐低氮地方品种鹅湖香稻和同等生育期的优质品种外引七号为试验材料，通过苗期水培和全生育期桶栽的方法，严格控制施氮量，综合前人耐低氮筛选指标。将株高、根长、植株鲜质量、植株干质量、叶绿素含量、全氮含量作为苗期的筛选指标，将株高、有效穗数、穗粒数、结实率、千粒质量、单株产量、叶绿素含量和全氮含量作为全生育期的筛选指标，依据苗期和成熟期的耐低氮评价指标来比较两品种耐低氮特性，同时检测在不同施氮水平下，氮代谢途径相关基因的表达水平，进一步探索鹅湖香稻耐低氮的分子机理。

1 材料和方法

1.1 试验材料

地方香型优质稻品种赣晚籼40号，又称鹅湖香稻(EHXD)。该品种全生育期158 d，具有农艺性状稳定，群体整齐一致，株叶形态好，分蘖力较强，穗粒数适中，结实率高，熟期转色好等特点。外引七号(WY7H)是大面积应用的优质稻品种。该品种全生育期155 d，具有株形适中，分蘖力较强，茎秆粗壮，叶片较挺等特点。因与鹅湖香稻生育期接近，便于氮肥处理和取样检测，故选用这2个品种来进行施氮处理，进而比较耐低氮特性。

1.2 试验方法

1.2.1 苗期试验 将两品种种子用2%的次氯酸钠溶液消毒30 min后，用去离子水冲洗干净，在28 ℃培养箱中浸种2 d，然后在37 ℃恒温箱中催芽2～3 d，挑选出长势均一(芽长5 mm左右)的幼苗转移至剪掉底部的PCR板上，放在塑料箱中先用去离子水培养至两叶一心，然后再用营养液培养。营养液采用国际水稻所标准营养液， 营养液设正常水稻营养液(N+，1.44 mmol/L NH4NO3)和低氮水稻营养液(N-，0.24 mmol/L NH4NO3) 2个处理[20]，每个处理设置5个重复。培养条件为：28 ℃ 14 h光照，22 ℃ 10 h黑暗。

在营养液中培养21 d后，选取每个重复中长势均一的植株20株，调查其株高、根长；在选取的20株中每2株用万分之一的天平称取鲜质量。调查完毕后放入105 ℃烘箱杀青30 min，然后置于70 ℃烘箱中烘干，再考察各个重复的干质量，并称取2 g分别用凯氏定氮法测总氮含量。

1.2.2 生育期试验 在江西农业大学农业科技园网室中进行生育期桶栽试验，塑料桶高24.0 cm、底部内径23.5 cm、上部外径29.0 cm，每桶装土20 kg，供试土壤为稻田0～20 cm耕层土。土壤理化性质：pH值15.6，有机质含量17.80 g/kg，碱解氮含量80.86 mg/kg，有效磷7.43 mg/kg，速效钾225.11 mg/kg。

对2个试验品种鹅湖香稻和外引七号进行正常氮(N+)和低氮(1/3 N+)处理。每桶3株，设置5个重复。磷肥作为底肥一次性施用5 g/桶，钾肥施3 g/桶。正常施尿素4 g/桶，底肥2 g/桶，分蘖肥1.2 g/桶，穗肥0.8 g/桶。低氮处理按照正常施尿素的1/3，别的施肥方案不变。

在桶栽的分蘖期和抽穗期分别用叶绿素计(SPAD-502， 日本莫尼塔公司Monita，日本)测剑叶的SPAD值；用丙酮法测各时期剑叶叶绿素含量[21]；用凯氏定氮法(凯氏定氮仪，Kjeltec 8400，FOSS)测植株的全氮含量[22]。每个试验处理，测3个生物学重复。待成熟期后，每个处理取5株考察单株有效穗、千粒质量、每穗实粒数和穗粒数，并计算结实率和单株产量。

1.2.3 荧光定量PCR检测 分别取水培苗期和桶栽分蘖期新鲜叶片，液氮速冻保存。提取总RNA，采用TaKaRa提取总RNA试剂盒(TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit Code No. 9767)， 步骤参照说明书。利用琼脂糖凝胶检测RNA完整性；利用NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.) 微量分光光度计检测RNA质量及浓度。反转录采用TaKaRa公司 PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit (Code No.6110A) 试剂盒的说明书进行。RT-PCR使用TaKaRa公司的SYBR®Premix ExTaqTMⅡ Kit (Tli RNaseH Plus) 进行试验。在Applied Biosystems的ABI PRISM 7500 HT RT-PCR仪上进行反应，水稻的OsACTIN基因作内参，试验中所得到的CT值(样品达到域值水平的循环数)的范围为15～28较为合理，试验数据结果采用2-ΔCT方法分析处理，每个PCR反应时间均使用3个生物学重复，所用RT-PCR引物见表1。

表1 RT-PCR所用引物Tab.1 RT-PCR primers

1.3 分析方法与数据处理

使用SSPS 13.0(SPSS Inc.，芝加哥伊利诺伊大学)和Microsoft Excel 2013软件进行数据分析。采用独立样本t检验分析低氮处理与正常条件下各性状的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 苗期水培耐低氮表型分析和耐低氮指标分析

在低氮条件下水培处理21 d后，与鹅湖香稻比较，外引七号植株在低氮处理下明显变矮小，且叶色变淡，而鹅湖香稻在处理前后的差异较小(图1)，说明鹅湖香稻具有较强的耐低氮特性。另外，在低氮胁迫条件下，植株根系往往会为了获取更多的氮营养而变得更复杂，即根长增加、根直径变大、根数增多和根表面积增加等，通过比较苗期水培低氮处理后两品种的根系变化可以发现，鹅湖香稻在低氮处理后根系有明显增多，而外引七号根系在低氮处理后的根系变短、变细(图1)，这进一步说明鹅湖香稻比外引七号具有更强的耐低氮胁迫特性。

A.鹅湖香稻苗期水培表型；B.外引七号苗期水培表型。 A.EHXD phenotype of the seedling stage under hydroponic conditions； B.WY7H phenotype of the seedling under hydroponic conditions.

为了进一步比较两品种的耐低氮特性，检测水培条件下正常氮和低氮处理下各项耐低氮指标。结果(表2、图2)表明：低氮胁迫与正常氮比较鹅湖香稻的株高、植株鲜质量、植株干质量、叶绿素含量和全氮含量均无显著差异，但是在低氮条件下，根长显著长于正常氮条件；而外引七号植株鲜质量、干质量、叶绿素含量和全氮含量都显著低于正常氮条件(P<0.05)。

表2 苗期耐低氮各项筛选指标比较分析Tab.2 Comparative analysis of screening indexes for low nitrogen tolerance in seedling stage

不同小写字表示处理间0.05 水平上差异显著。图3-4同。 Different small letters are significantly different at the 0.05 probability level among treatments.The same as Fig.3-4.

2.2 生育期耐低氮指标分析

为了进一步分析鹅湖香稻的耐低氮特性，本研究进行不同施氮处理生育期桶栽试验，分别在分蘖期和抽穗期，对重要的耐低氮指标SPAD值、叶绿素(以鲜质量计)含量和植株全氮含量检测分析。结果表明，在分蘖期，鹅湖香稻在正常氮和低氮水平下，各指标均无显著差异，而外引七号各指标在低氮处理下均显著低于正常氮条件(图3-A-C)；在抽穗期，外引七号的各指标同样在低氮处理下均显著低于正常氮条件；鹅湖香稻仅有SPAD值在低氮处理显著低于正常氮处理，其他指标均无显著差异(图3-D-F)。这些结果进一步表明，鹅湖香稻比外引七号具有更强的耐低氮特性。

2.3 农艺性状比较分析

为了进一步分析两品种的耐低氮特性，本研究分别考察了低氮和正常氮条件下两品种的各农艺性状指标。结果表明：鹅湖香稻在低氮处理和正常氮条件下株高、有效穗数、穗粒数、结实率、千粒质量和单株产量均无显著差异；而外引七号在低氮条件下的株高、有效穗数及单株产量显著低于正常氮条件，而其他3个农艺性状并没有显著差异(表3)。这些结果说明，低氮胁迫对水稻的株高、有效穗数和单株产量影响较大，因而这3个农艺性状可以作为耐低氮的筛选指标。

2.4 氮代谢途径调控基因表达分析

植物氮代谢同化途径GS/GOGAT循环中，OsNADH-GOGAT1、OsNADH-GOGAT2和OsFD-GOGAT3个基因起到重要作用，另外耐低氮重要基因TOND1也参与了氮代谢调控途径，为了进一步探索鹅湖香稻耐低氮的分子调控机制，本研究检测了这4个基因在不同施氮水平下表达情况。在苗期水培条件下，这4个基因在鹅湖香稻的正常氮和低氮条件下没有显著差异表达，而在外引七号的低氮条件下表达量均显著低于正常氮条件(图4-A)。在分蘖期，OsNADH-GOGAT1、OsNADH-GOGAT2和OsFD-GOGAT这3个基因在鹅湖香稻中未存在显著差异表达，而TOND1基因在低氮胁迫下表达量显著高于正常氮条件；而对于外引七号，除了基因TOND1表达量无显著差异之外，其他3个基因在低氮条件下表达量均显著低于正常氮条件(图4-B)。这些结果证实了鹅湖香稻在低氮水平下，氮代谢同化途径中的重要基因表达量并未受到显著抑制，而水稻中重要的耐低氮基因TOND1表达量则显著增加，这也进一步从分子层面验证了鹅湖香稻耐低氮特性。

A-C.桶栽分蘖期耐低氮指标比较分析；D-F.桶栽抽穗期耐低氮指标比较分析。 A-C.Comparative analysis of low nitrogen tolerance indexes at the tillering stage of barrel planting； D-F.Comparative analysis of low nitrogen tolerance indexes at the heading stage of barrel planting.

表3 生育期耐低氮筛选指标比较分析Tab.3 Comparative analysis of screening indexes for low nitrogen tolerance in growth period

A.水培苗期相关基因的表达水平；B.桶栽分蘖期相关基因的表达水平。 A.Expression levels of related genes in hydroponics at the seedling stage；B.Expression levels of related genes at the tillering stage of barrel planting.

3 讨论与结论

许多野生稻和地方品种均含有耐低氮的特性，挖掘这些耐低氮种质资源，应用于耐低氮品种培育是提高氮肥利用率的有效措施。研究者非常重视挖掘各个地方品种以及野生稻衍生系的耐低氮特性评价与筛选[23-24]。本研究在前人耐低氮种质资源筛选评价指标的基础上，结合苗期水培和全生育期桶栽的方式来开展不同氮处理试验，该方法能更精确的控制施氮水平，避免在田间由施氮不均造成的数据误差。本研究在苗期水培和全生育期桶栽条件下，低氮胁迫处理外引七号植株形态和评价指标大多数出现显著差异，而鹅湖香稻则未出现显著差异变化，这充分说明鹅湖香稻具有较强的耐低氮胁迫特性。

前人研究发现，大部分氮高效品种在低氮条件下一般都具有更发达的根系，进而更适宜吸收营养元素[25]。本研究苗期水培条件下，能明显的观察到鹅湖香稻根系更加发达，这与前人研究结果一致。另外，在前人评价水稻耐低氮指标中，很少测定植株全氮含量，本研究在不同施氮条件下，测定两品种不同时期的全氮含量，很直观的表明优质地方品种稻鹅湖香稻在低氮条件下植株全氮含量并没有显著减少，说明鹅湖香稻自身具备氮高效吸收能力，但植株体内的氮素转运机制还需进一步研究。

为了让耐低氮种质资源更方便的应用于水稻育种中，不仅研究者要建立高效的水稻耐低氮和氮高效评价体系，同时要进一步挖掘和利用水稻自身的氮高效和耐低氮基因。近些年，对水稻氮吸收、转运和利用相关基因的克隆研究也受到重视，一些相关基因被陆续报道[26-29]。Zhang等[28]克隆的水稻耐低氮关键基因TOND1表达水平可以直接的反映水稻的耐低氮水平。在植物体内，谷氨酰胺合成酶(GS)/谷氨酸合成酶(GOGAT)循环途径是铵根离子同化的主要途径，GS/GOGAT循环途径产生的谷氨酸和谷氨酰胺可进一步合成蛋白质，是植物能量来源重要途径之一[30-33]，检测该循环途径的相关基因表达水平可以从分子层面反映植物的氮吸收水平。因此，本研究结合前人的报道结果，对参与水稻氮代谢重要的GS/GOGAT循环途径相关基因和耐低氮重要基因TOND1进行表达分析，尤其是鹅湖香稻中的TOND1基因，在低氮条件下依然可以高水平表达，这进一步从分子层面表明鹅湖香稻的耐低氮特性。然而，对于优质地方品种鹅湖香稻的自身耐低氮基因挖掘还有待进一步研究。

总之，本研究对鹅湖香稻和外引七号耐低氮特性，进行了充分筛选和鉴定，得出优质地方品种鹅湖香稻在低氮胁迫条件下，苗期株高、植株鲜质量和干质量都不存在显著差异；生育期农艺性状也均无显著差异，这些结果都表明鹅湖香稻具有优良的耐低氮和氮高效特性，这为进一步充分挖掘鹅湖香稻耐低氮相关基因，利用其遗传优势来培育耐低氮水稻新品种奠定了基础，对减少氮肥投入、减轻环境污染具有十分重要的意义。