石桂英白 琳

(中国医学科学院医学实验动物研究所,北京协和医学院比较医学中心,国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室,国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室,北京 100021)

随着科学技术的发展,干细胞和再生医学受到广泛关注。人们对干细胞的了解日渐深入,对干细胞的种类和功能的探索日益广泛,从而使干细胞在再生医学领域拥有远大的应用前景,同时为多种重大疾病的治疗提供了新的思路和工具[1-3]。由于干细胞产品种类繁多、不同批次差异明显、细胞复杂多变,因此对应用于临床治疗的干细胞制剂,进行质量控制尤为重要和关键[4-5]。干细胞作为活性外源物质,移植入机体后,机体会对这种外源刺激产生各种反应,如释放细胞因子、产生免疫反应等[6-7]。因此,对干细胞的质量控制,需要了解干细胞进入机体后的各种反应,这就需要应用合适的动物模型。这种动物模型,既要能允许干细胞植入、分化,机体产生的反应又要最大程度与人体相似。普通动物有自身的免疫系统,对移植的干细胞会产生排斥反应,这就影响了干细胞的植入效率;免疫缺陷动物模型,由于自身免疫缺陷不会排斥移植的外源干细胞,但是这种动物模型不能很好的反映干细胞进入人体的反应;为了能更好的模拟人体免疫环境,人们构建了人源化小鼠。人源化小鼠是在免疫缺陷小鼠体内建立了人的免疫系统,因此,干细胞移植到人源化小鼠后,既保证了移植效率,又能模拟人体的反应。因此采用免疫缺陷小鼠和人源化小鼠,可以更好的模拟干细胞移植后人体免疫反应,更加准确的评价干细胞产品的安全性。因此,本文综述了免疫缺陷小鼠和人源化小鼠在干细胞质量控制、干细胞治疗评价中的应用成果,期望通过对已有研究的总结为干细胞临床前安全性评价的标准化提供资料和信息。

1 干细胞的免疫原性

干细胞种类较多,根据分化能力可分为全能干细胞,如胚胎干细胞;多能干细胞,如造血干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞等。干细胞表达的一些蛋白质或者复合物具有免疫原性[5-8]。如人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)表达主要组织相容性抗原复合物Ⅰ类分子和ABO 抗原,可激活机体免疫反[4,6-7];核转移胚胎干细胞(nuclear transfer embryonic stem cells,NT-ESCs),是将成纤维细胞的核转入去核的卵母细胞中,这种细胞含有卵母细胞的线粒体抗原,可以激活T 细胞,产生免疫排斥反应[7];诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的免疫原性主要来自于其表观遗传学改变、蛋白编码突变和融合蛋白[6-7];间充质干细胞(mesenchymal stromal/stem cells,MSC)表达人白细胞抗原Ⅰ类分子(human leucocyte antigen,HLA)可以激活免疫应答[8]。不同干细胞的免疫原性见表1。

另外,有些干细胞,如间充质干细胞,其治疗效果主要通过调节机体免疫反应发挥作用,在评价其安全性和有效性时,动物模型自身的免疫反应会影响实验结果,不能反映干细胞的真实作用;应用免疫缺陷动物能真实反映干细胞的作用,而应用人源化动物,则可以反映人的免疫系统对干细胞的应答情况,更有利于了解干细胞植入人体后的机体反应[9]。

2 免疫缺陷小鼠模型

免疫缺陷小鼠是指免疫功能缺陷的小鼠,通常是由先天性遗传突变导致,或者用人工方法培育而成[10]。根据免疫细胞缺失种类的不同,可以分为:1.T 淋巴细胞功能缺陷小鼠:裸小鼠是最早发现的免疫缺陷小鼠,先天无胸腺,从而导致T 淋巴细胞缺失。裸小鼠的发现和应用是免疫缺陷动物研究和应用的起点,其在免疫学、肿瘤学、细胞生物学等领域得到普遍应用;2.B 淋巴细胞功能缺陷小鼠:CBA/N 小鼠是X 染色体连锁的B 细胞功能缺陷小鼠,可用于研究B 淋巴细胞的产生、功能等,在免疫、炎症及自身免疫疾病的研究中有广泛应用;3.NK细胞功能缺陷小鼠:Beige 小鼠是NK 细胞活性缺陷的突变小鼠,用于器官移植等研究;4.联合免疫缺陷小鼠:即多种免疫细胞或功能同时缺失或缺陷的小鼠,如SCID 小鼠是T、B 细胞联合免疫缺陷小鼠;BNSG 小鼠是 T、B、NK 三联免疫缺陷小鼠。

表1 不同干细胞的免疫原性Table 1 Immunogenicity of different Stem Cells

目前常用的联合免疫缺陷小鼠有SCID 小鼠、NOD/SCID 小鼠、NSG、NRG 小鼠等。SCID 小鼠是由于Prkdc(protein kinase DNA-activated catalytic)基因突变,导致功能性T 淋巴细胞和B 淋巴细胞缺失,但有正常的NK 细胞,表现为细胞免疫和体液免疫的重度联合免疫缺陷[11]。SCID 小鼠广泛应用于肿瘤学、免疫学、微生物学、生殖医学等领域。SCID小鼠的缺点是渗漏现象,即少量小鼠在青年期有部分免疫功能恢复,这种渗漏现象不会遗传[12]。NOD/SCID 小鼠,即非肥胖性糖尿病免疫缺陷小鼠,是SCID 小鼠与NOD 小鼠即非肥胖性糖尿病小鼠回交获得的免疫缺陷小鼠[13]。与 SCID 小鼠相比,NOD/SCID 小鼠的NK 细胞活性低,免疫恢复几率更低,各种肿瘤细胞可移植到NOD/SCID 小鼠体内,排斥反应和移植物抗宿主病的发生率更低。NSG 小鼠即 NOD/scid/gamma 小鼠,是在 NOD/SCID 小鼠基础上敲除了 IL-2 受体 γ 链基因[14]。IL-2 受体γ 链是多种细胞因子的共同受体亚基,这些细胞因子包括 IL2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15 和 IL-21等,它们都具有重要的免疫功能。IL2 受体γ 链基因敲除后,小鼠机体免疫功能降低,特别是NK 细胞,其活性几乎丧失,小鼠出现重度免疫缺陷表型,没有成熟的T 淋巴细胞、B 淋巴细胞和功能性NK细胞,同时细胞因子的信号传递能力缺失[15-16]。NSG 小鼠是目前世界上免疫缺陷程度最高的工具小鼠;在多个领域都有广泛应用,如免疫学、感染性疾病、干细胞生物学等。NRG 小鼠即 NOD/rag/gamma 小鼠,是在NOD 的背景下敲除了Rag1 和IL-2 受体γ 链基因,NRG 小鼠对辐射和基因毒性药物的耐受性更强,更适用于细胞和组织移植研究[17]。另外在NSG 小鼠基础上进行基因修饰,衍生出多个免疫缺陷小鼠品系,如NSG B2m、NSG-SGM3 等,这些小鼠在异种移植中更有优势[18-19]。

3 人源化小鼠模型

人源化小鼠模型是指带有功能性的人类基因、细胞或组织的小鼠模型[15]。人源化小鼠的构建,包含供体细胞和免疫缺陷小鼠两个方面。曾经使用的供体细胞包括人外周血单个核细胞、人外周血淋巴细胞、脐带血造血干细胞、动员后的成熟造血干细胞,以及胚胎肝、胸腺组织等。可以选用的免疫缺陷小鼠包括早期使用的裸小鼠,以及后来发展起来的 SCID 小鼠、NOD/SCID 小鼠、NSG 小鼠等。供体细胞和作为受体的免疫缺陷小鼠都会影响人源化小鼠的人源化效果,从而影响人源化小鼠的应用。

早期构建人源化小鼠模型,是将人外周血单个核细胞或外周血淋巴细胞移植到裸小鼠体内,由于裸小鼠只是T 淋巴细胞缺失,而其它免疫细胞正常,出现免疫排斥反应,影响移植效果[11]。随着科技发展,人们分离出各种类型的造血干细胞,如脐带血来源的造血干细胞、动员后的成熟造血干细胞等,都成为良好的供体细胞。同时,人们也培育出新的免疫缺陷小鼠,其免疫缺陷程度更加严重,有利于移植细胞的存活、分化等。

骨髓-肝-胸腺(bone marrow-liver-thymus,BLT)人源化小鼠是人源免疫系统重建最完善的小鼠模型[20]。构建BLT 人源化小鼠,需要对免疫缺陷小鼠进行半致死剂量的照射,将同一个体来源的人胚胎肝和胸腺组织块植入小鼠肾包膜下,再输入同一个体的造血干细胞。BLT 人源化小鼠模型的人源化环境更强,输入的人造血干细胞可以分化成多个细胞系,包括T 细胞、B 细胞、单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞、红细胞、血小板等。BLT 人源化小鼠还建立了人粘膜免疫系统和二级淋巴组织,并且能产生人源性的适应性免疫应答,如生成IgM、IgG 等免疫球蛋白。所以,BLT 人源化小鼠对植入的外源性组织或细胞的免疫应答反应更接近人类机体自然反应。BLT 人源化小鼠的构建和应用,促进了感染性疾病、肿瘤、再生医学、免疫学、干细胞治疗等研究领域的发展[21-25]。

4 免疫缺陷和人源化小鼠模型在干细胞质量控制中的应用

目前国内外已开展了多项干细胞临床应用研究[1-4],应用免疫缺陷小鼠和人源化小鼠进行临床前研究,对多种细胞进行体内研究,评价其安全性和有效性。如对造血干细胞的相关研究,了解了造血干祖细胞在体内扩增、归巢、植入及分化机制[26-28];对人iPSC 来源的平滑肌细胞、视网膜色素上皮细胞的研究,发现由于免疫原性抗原的异常表达,两种分化细胞的免疫原性不同[29];对犬iPSC 来源的MSC[30]、人羊膜上皮细胞[31]及其来源的肝细胞样细胞[32]、人成纤维细胞转分化的胰岛素分泌细胞[33]、胚胎干细胞来源的星形胶质细胞[34]等的安全性研究,发现这些细胞均无成瘤性和促瘤性;应用免疫缺陷小鼠构建构建疾病模型,评价造血干祖细胞治疗的有效性[35];人羊膜上皮细胞来源的肝细胞样细胞对急性肝损伤有治疗作用[32];博来霉素诱导人源化小鼠肺纤维化模型,注射人MSC 可以调节T 细胞紊乱,减轻肺纤维化程度[36];胚胎干细胞来源的星形胶质细胞对肌萎缩性嵴髓侧索硬化症有治疗效果[34]。综上可见,免疫缺陷小鼠和人源化小鼠在干细胞质量控制中发挥重要作用,为干细胞治疗的安全性和有效性提供科学依据。安全性评价包括毒性实验、致瘤性实验、促瘤性实验等。

4.1 毒性实验

干细胞制剂中即有干细胞,又有维持干细胞活性的支持物质,而且不同种类和不同批次的干细胞差异较大。因此,有必要对干细胞制剂进行毒性实验。干细胞的毒性实验可分为急性毒性实验和长期毒性实验[2]。实验中,干细胞植入动物体内的途径主要是静脉注射,包括尾静脉注射和眼球后静脉丛注射两种方式[30,32,37-38],以及治疗部位的原位注射[34]。急性毒性实验通常采用单次或多次大剂量细胞注射,一般细胞用量为每千克1×108～2.5×108细胞,注射细胞后观察 4 ～10 周[34,37-39]。长期毒性实验中注射细胞的剂量为每千克2.5×106～5×107细胞体重,注射细胞后观察3～4 个月[31,34,37-39]。观察及检测指标包括体重、行为、血常规、细胞因子、病理变化等。对人骨髓间充质干细胞、羊膜间充质干细胞及CART19 等细胞的研究中,未发现明显的急性或长期毒性反应[31,34,37-39]。

4.2 致瘤性实验

干细胞具有自我更新和增殖能力,且其生长调节机制类似肿瘤细胞,已有研究表明,人胚胎干细胞和诱导多能干细胞可在动物体内可形成良性或恶性畸胎瘤。干细胞制剂同样存在致瘤性的可能,因此,对于干细胞制剂有必要检测其肿瘤形成能力。已有研究中,干细胞致瘤性实验,多采用NSG小鼠为受体,在其背部皮下注射干细胞,细胞剂量为 5× 104～ 5 × 106细胞/注射点,注射后每天观察肿瘤形成情况,观察时间 20 ～50 周[31,32,34,37-40]。在角质形成细胞、羊膜上皮干细胞、皮肤成纤维细胞、人骨髓间充质干细胞等致瘤性研究中,均未发现肿瘤形成[31,32,34,37-40]。

4.3 促瘤性实验

除了自身形成肿瘤,干细胞还可以影响体内已有肿瘤的生长增殖,这就是干细胞的促瘤性。为检测干细胞制剂对肿瘤生长是否有影响,可在免疫缺陷小鼠注射肿瘤细胞系的同时注射干细胞,以观察干细胞制剂对肿瘤形成及生长的作用[31,32,34,37-40]。肿瘤细胞可用3×106HeLa 或Raji 肿瘤细胞,干细胞用量为 5×104～5×106细胞,注射后每天观察肿瘤形成情况,观察时间20 ～50 周。羊膜上皮细胞对肿瘤形成及生长无显著影响[31,32,34,37-40]。

5 展望

在干细胞制剂的质量控制和安全性评价中,动物模型,尤其是免疫缺陷小鼠模型和人源化小鼠模型发挥了极大作用。随着科技的发展,免疫缺陷小鼠和人源化小鼠品系日益增多,其免疫缺陷程度越来越高,也能更好地模拟人体对干细胞制剂的反应,这将更有利于各种干细胞制剂的评价和质量控制,从而为干细胞治疗提供科学依据。从已有研究看,多种干细胞都没有显著的毒性、致瘤性、促瘤性等,说明干细胞制剂的安全性是可靠的。但是干细胞治疗的有效性,需要相应的疾病动物模型进行评价,这就需要构建出各种疾病动物模型,从而为干细胞治疗的有效性提供科学依据。