白振军张慧宇郭敏芳

(1.山西大同大学中医药健康服务学院,山西大同 037009; 2.山西大同大学医学院,山西大同 037009)

阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease,AD)是一种常见的神经退行性疾病,随着世界人口老龄化的到来,AD 的发病率持续升高,导致了巨大的社会和经济负担[1]。由于到目前为止AD 确切的发病机制还不完全清楚,因此临床上常用的治疗仍然是一些对症治疗,没有有效的病因疗法[2]。氧化应激是由于细胞过度暴露于活性氧(reactive oxygen species,ROS)等自由基引起的,是ROS 的形成与抗氧化防御能力之间出现不平衡的结果,ROS 会引发细胞内信号传导级联的氧化爆发,并且参与神经元细胞的死亡[3-4]。众所周知,大脑是最易受氧化损伤的区域,因为它耗氧量高并且抗氧化剂系统相对较弱[5],因此,氧化应激在AD 的病理过程中发挥关键作用[6]。这些研究证明抗氧化疗法是氧化应激相关疾病例如AD 的最有前途的治疗选择之一。

有证据表明,体内排毒系统通过激活核因子E2相关因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)信号通路来对抗氧化剂的损伤而发挥神经保护作用[7]。Nrf2 是重要的氧化还原调节转录因子,激活的Nrf2 从细胞质转移到细胞核,激活其下游一系列内源性氧化还原调节酶如血红素加氧酶1(hemeoxygenase - 1,HO-1),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和NADPH 醌氧化还原酶1(NADPH: quinone oxidoreductase 1,NQO1)来触发细胞保护作用[8-9],且最新研究表明Nrf2 激活不足与AD 密切相关[10]。

毛蕊异黄酮是从黄芪中分离出来的有活性的黄酮类单体成分,具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤和神经保护作用[11]。有研究表明,毛蕊异黄酮可以减轻AD 的氧化应激和炎性反应,改善 AD 的认知缺陷[12]。为了进一步研究毛蕊异黄酮的抗氧化应激和神经保护作用,本实验以人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 为研究对象,用H2O2构建氧化应激细胞模型,研究毛蕊异黄酮的抗氧化保护作用及其可能的机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

人源神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 细胞株由军事医学研究院军事认知与脑科学研究所提供。

1.2 主要试剂与仪器

毛蕊异黄酮(B9938)、牛血清白蛋白(B2064)购自 Sigma-Aldrich 公 司 ( 美 国); 胎 牛 血 清(16140063)、青霉素-链霉素混合液(15140163)和高糖DMEM(21013024)购自Gibco 公司(美国);兔抗 Nrf2 抗 体 ( ab62352)、兔 抗 NQO1 抗 体(ab80588)、兔 抗 HO-1 抗 体 ( ab13243)、Alex Flour® 488 ( ab150077 ) 和 Alex Flour® 594(ab150080)标记的山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗(ab205718)均购自Abcam 公司(美国);RIPA裂解液(P0013B)、细胞核蛋白和细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0027)、4-甲基偶氮唑蓝(MTT)检测试剂盒(ST316)、SOD 活性检测试剂盒(S0103)和丙二醛(MDA)检测试剂(S0131M)均购自碧云天生物技术有限公司(中国,上海)。

HERAcell 240i 二氧化碳培养箱购自美国Thermo 公司;LA2-5A1 型生物安全柜购自新加坡ESCO 公司;BX51 荧光显微镜购自日本Olympus 公司;H1M 全功能酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司;SYSTEM GelDoc XR+凝胶成像系统购自美国Bio-Rad 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

SY5Y 细胞用高糖DMEM 基础培养基(含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素混合液),置于5%CO2、37℃的CO2培养箱中进行培养,当细胞生长达80%的时候进行传代。

1.3.2 毛蕊异黄酮浓度筛选

将指数生长期的SY5Y 细胞以每毫升5×103个的密度接种于96 孔板中。待细胞贴壁后加入不同终浓度的毛蕊异黄酮(0、0.035、0.070、0.140、0.281 μmol/mL),每个浓度设6 个复孔。24 h 后每孔加入20 μL 的 MTT 溶液(0.012 mol/L),37℃继续孵育 3～4 h 后离心弃上清液,每孔加入150 μL 的DMSO,震荡5 min 使结晶溶解,酶标仪检测490 nm 波长各孔的光密度值。细胞的存活率(%)= (加药孔-调零孔)/(对照孔-调零孔)×100%。选取可以增加细胞活性或者对细胞活性无明显影响的毛蕊异黄酮浓度作为后续实验的使用浓度。

1.3.3 SY5Y 细胞氧化损伤模型的建立及实验分组

采用H2O2刺激SY5Y 细胞建立氧化损伤模型。实验分为 3 组:PBS 对照组、H2O2(50 μmol/L)模型组、H2O2(250 μmol/L)+毛蕊异黄酮(0.035 μmol/mL)干预组。培养24 h 后,收集上清并离心,-80℃冰箱冻存备用。

1.3.4 MTT 法检测毛蕊异黄酮对SY5Y 细胞的保护作用

药物作用24 h 后,MTT 法检测各组细胞活性,评估毛蕊异黄酮对H2O2致细胞损伤的保护作用。

1.3.5 氧化应激指标的检测

取出冻存备用的细胞上清液,分别按照试剂盒说明书检测丙二醛MDA 的水平和超氧化物歧化酶SOD 的活性。

1.3.6 免疫荧光染色检测SY5Y 细胞中Nrf2 的核转位情况和HO-1 的表达

为检测毛蕊异黄酮干预SY5Y 细胞是否可以使Nrf2 表达增加并转移到核内,采用免疫荧光染色检测细胞中Nrf2 表达的变化,同时检测HO-1 的表达。将细胞接种于放置好细胞爬片的24 孔板中,密度为每毫升4×105个,各组分别加入H2O2和毛蕊异黄酮,培养24 h 后,用4%多聚甲醛固定30 min,用含有0.3% Triton X-100 和 1% BSA 的 PBS 室温下封闭1 h,加入兔抗小鼠Nrf2 或者兔抗小鼠HO-1 一抗,4℃孵育过夜,加488 或者594 标记的山羊抗兔IgG 二抗,室温下孵育2 h,5%甘油封片,荧光显微镜扫描观察。

1.3.7 Western blot 法检测 SY5Y 细胞总 Nrf2、细胞核内 Nrf2、NQO1 和 HO-1 蛋白水平

药物作用24 h 后,用RIPA 裂解液或者是细胞核蛋白和细胞浆蛋白抽提试剂盒提取蛋白,BCA 法进行蛋白定量。采用10% SDS-PAGE 不连续凝胶分离蛋白,转膜,5%脱脂奶粉封闭1 h,加入用封闭液稀释的兔抗小鼠 Nrf2 抗体(1 ∶500)、兔抗小鼠NQO1(1 ∶500)或兔抗小鼠 HO-1 抗体(1 ∶500),4℃冰箱孵育过夜,次日加入HRP 标记的山羊抗兔IgG二抗(1 ∶5 000),2 h 后滴 ECL 发光液于膜上,随后用Bio-Rad 凝胶成像系统显影并分析。

1.4 统计学方法

计量资料以平均数±标准差(±s)来表示,采用SPSS 15.0 对实验数据进行统计学处理,组间比较采用单因素方差分析,P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 毛蕊异黄酮浓度筛选

通过MTT 法检测毛蕊异黄酮对细胞的毒性作用,筛选合适的药物浓度,结果显示毛蕊异黄酮终浓度 为 0.035 μmol/mL、0.070 μmol/mL、0.140 μmol/mL、0.281 μmol/mL 时的细胞活力分别为109.83% ± 8.57%、100.67% ± 11.64%、80.83% ±7.94%、50.33% ± 9.22%,与对照孔 99.33% ±7.34% 相比,0.035 μmol/mL 毛蕊异黄酮可以增加细胞活性(P＜0.05),随着药物浓度的增加,细胞活力随之降低,0.070 μmol/mL 毛蕊异黄酮处理组的细胞活性和对照组之间无显著性差异(P＞0.05),而0.140 μmol/mL 毛蕊异黄酮处理组的细胞活性显著降低,与对照组比较有统计学意义(P＜0.01)(图1),因此后期实验毛蕊异黄酮选择0.035 μmol/mL 作为药物干预浓度。

2.2 毛蕊异黄酮对H2O2 诱导SY5Y 细胞损伤的保护作用

用 250 μmol/L H2O2刺激 SY5Y 细胞,药物组同时加0.035 μmol/mL 毛蕊异黄酮进行处理,药物作用24 h 后采用 MTT 法检测细胞活性。结果显示,与对照组相比,H2O2损伤细胞24 h 后,细胞活力明显下降(P＜0.001),而毛蕊异黄酮能够显著抑制H2O2对SY5Y 细胞造成的损伤作用,细胞活力明显增加(P＜0.01,图2)。

2.3 毛蕊异黄酮对H2O2 诱导SY5Y 产生的SOD和MDA 的影响

测量自由基的氧化终产物丙二醛(MDA)和抗氧化酶(SOD)的量能有效的反应细胞的氧化应激状态。与PBS 对照组比较,H2O2刺激后导致SY5Y细胞中MDA 含量明显升高(P＜0.001),SOD 活性明显降低(P＜0.001)。毛蕊异黄酮能够显著降低MDA 的水平(P＜ 0.001),提高 SOD 的活性(P＜0.01,图3),抑制H2O2诱导的氧化应激损伤。

2.4 毛蕊异黄酮对 H2O2 诱导 SY5Y 细胞表达Nrf2 的影响

为了探讨毛蕊异黄酮抑制H2O2致SY5Y 细胞氧化损伤作用的机制,本研究采用免疫荧光和Western blot 方法分析了Nrf2 的表达及其核转位情况。免疫荧光结果显示,PBS 对照组中的Nrf2 主要分布在细胞质中,细胞核中的含量较少,模型组细胞质和细胞核内Nrf2 含量均有所减少,而毛蕊异黄酮作用24 h 后,细胞核中的Nrf2 含量明显增加,胞质内Nrf2 含量减少,说明毛蕊异黄酮可以促进Nrf2激活并向核内转位。Western blot 蛋白定量结果发现,与PBS 对照组比较,H2O2组总的Nrf2 和细胞核内Nrf2 表达均降低(P＜0.05),而毛蕊异黄酮作用后总的Nrf2 和细胞核内Nrf2 表达均明显增加(P＜0.001,图4)。

2.5 毛蕊异黄酮对H2O2 诱导的SY5Y 细胞抗氧化蛋白NQO1 和HO-1 表达的影响

免疫荧光检测HO-1 的表达,同时利用Western blot 法检测 NQO1 和 HO-1 的表达。免疫荧光结果显示毛蕊异黄酮可以增加 HO-1 的表达,同时Western blot 结果显示,与PBS 对照组相比,模型组细胞NQO1 和HO-1 的表达显著降低(P＜0.01)。与H2O2组相比,毛蕊异黄酮处理组NQO1 和HO-1表达明显增加(P＜0.05,图5)。

图1 不同浓度毛蕊异黄酮对SY5Y 细胞活性的影响Figure 1 Effect of different concentrations of calycosin on the activity of SY5Y cells

图2 毛蕊异黄酮对H2O2 诱导SY5Y 细胞损伤的保护作用Figure 2 Protective effect of calycosin on H2O2 induced SY5Y cell damage

图3 毛蕊异黄酮对H2O2 诱导SY5Y 细胞产生的SOD 和MDA 的影响Figure 3 Effect of calycosin on the level of SOD and MDA induced by H2O2 in SY5Y cells

图4 毛蕊异黄酮对H2O2 损伤SY5Y 细胞Nrf2 表达的影响Figure 4 Effect of calycosin on the expression of Nrf2 in SY5Y cells injured by H2O2

3 讨论

氧化应激已被认为是AD 的发病机制之一[13]。与其他器官相比,由于高氧消耗和缺乏抗氧化酶,神经元更容易受到自由基的破坏[14]。在AD 患者的组织样本中明显出现了氧化应激增加的迹象,并在疾病中证明了由ROS 直接诱导或者是由脂质过氧化产物间接诱导的蛋白质修饰[15]。有研究发现许多用于AD 治疗的化合物具有有效的抗氧化特性,例如司立吉林,黄酮类,褪黑素和类胡萝卜素等[16]。因此本实验研究毛蕊异黄酮的抗氧化应激效果,进一步为黄酮类药物治疗AD 提供实验依据。

毛蕊异黄酮,从黄芪中分离出来的一种有效成分,它的极性很小,不仅可以去除游离的自由基,而且可以穿透生物膜脂质双层去除结合的活性氧并延迟脂质生物膜的过氧化,从而提高人体的抗氧化应激能力[17]。且有研究表明,毛蕊异黄酮可以通过减少氧化应激和炎症反应,并改善AD 模型小鼠的认知功能,并缓解AD 的症状[12]。也有研究显示,毛蕊异黄酮可以减轻缺氧缺糖/复氧复糖导致的PC12 细胞凋亡,发挥神经保护作用[18]。然而,关于毛蕊异黄酮抗氧化应激的机制还不十分清楚。SHSY5Y 是多巴胺能神经元细胞,被广泛用于研究神经退行性疾病如AD 和PD 的细胞模型[19]。因此本实验采用H2O2刺激SH-SY5Y 建立氧化应激损伤模型,检测毛蕊异黄酮的抗氧化作用及其可能的机制。实验结果显示毛蕊异黄酮浓度在0.035 μmol/mL 时,可以增加细胞活性,0.140 μmol/mL 时细胞活性开始降低,因此我们选定0.035 μmol/mL 为毛蕊异黄酮的干预浓度。同时结果显示,250 μmol/L H2O2刺激SY5Y 细胞可以使其细胞存活率降低,而毛蕊异黄酮可以抑制H2O2诱导的细胞损伤,使细胞存活率增加,表明毛蕊异黄酮对 H2O2诱导的SY5Y 细胞氧化应激损伤具有保护作用。

图5 毛蕊异黄酮对H2O2损伤SY5Y 细胞NQO1 和HO-1 表达的影响Figure 5 Effect of calycosin on the expression of NQO1 and HO-1 in SY5Y cells injured by H2O2

MDA 是自由基发生脂质过氧化的终产物,SOD是体内自由基的天然清除剂,可以保护机体免受氧化损伤,因此MDA 和SOD 是反应氧化应激的两个重要指标[20]。本研究发现,H2O2可使 SY5Y 细胞MDA 含量明显升高,SOD 活性明显降低。毛蕊异黄酮处理组SY5Y 细胞MDA 含量降低,SOD 活性显著升高。显示毛蕊异黄酮可通过增加抗氧化酶SOD的活性来抵抗H2O2所造成的氧化性损伤,表明其具有良好的抗氧化应激作用。

Nrf2/HO-1 信号通路是维持细胞氧化还原稳态的关键途径[21]。Nrf2 激活并从细胞质转移到细胞核,进而诱导下游保护性靶基因NQO1 和HO-1 的表达,从而维持细胞内稳态[22]。有研究表明,H2O2刺激SY5Y 细胞后,Nrf2 的转录活性降低,细胞核内Nrf2 及其下游分子 NQO 和 HO-1 的表达明显降低[23]。本研究结果表明,H2O2刺激细胞后总Nrf2及核内Nrf2 的表达均较对照组减少,而毛蕊异黄酮干预能够激活Nrf2 使其表达增加并促使其向核内转位。同样Western blot 蛋白定量结果表明,毛蕊异黄酮干预能够明显增加H2O2损伤后总Nrf2 和核内Nrf2 的表达,并且能够明显增强H2O2损伤后Nrf2诱导的II 相辅酶 NQO1 和HO-1 的表达,提示毛蕊异黄酮可能通过激活Nrf2/HO-1 信号通路发挥抗氧化应激的保护作用。

综上所述,毛蕊异黄酮能够抵抗H2O2诱导的SH-SY5Y 氧化损伤,其机制可能是激活了Nrf2,并促进Nrf2 向核内转位,进而上调了其下游抗氧化酶NQO1 和HO-1 的表达,然而毛蕊异黄酮发挥抗氧化损伤和神经保护作用的确切机制尚需进一步研究。