王 鑫，李 楠，齐佳慧，李晓辉，蔺彬彬

(哈尔滨学院 食品工程学院，哈尔滨 150086)

0 引 言

金银花是药食两用型的中药材，其主要成分中清热解毒的活性物质通常被认为是有机酸绿原酸。近年来，利用回流法、超声波法和微波法提取植物中有效成分被得到了广泛的应用及关注[1-4]。李杰等[5]用水热法对提取金银花中绿原酸的工艺进行了研究。他们选取料液比、提取温度及提取时间为控制因素，绿原酸提取率为评价指标，采用响应面分析法优化提取条件。魏锐等[6]选取料液比、温度、提取次数、时间为自变量，以绿原酸的得率为评价指标，利用响应面分析法优化杜仲叶中绿原酸的提取工艺。王省超等[7]用超声波法来提取罗布麻茶中的绿原酸，分别改变料液比、超声时间、超声波功率和甲醇的浓度等，探究它们对绿原酸浓度的影响，并且设计了正交实验，优化了提取工艺，同时也将提取出来的绿原酸用高效液相色谱法测定其浓度。绿原酸被称为“第七营养素型的”中的重要一员，并广泛应用于医疗保健行业[8-12]。本文旨在对比研究不同方法、多种因素对金银花中绿原酸提取率的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金银花药材，购于黑龙江省药材公司；绿原酸标准品(≥ 98%)，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈(色谱纯 99.9%)，购于美国 Tedia 公司；无水乙醇(分析纯)、甲醇(色谱纯)，购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.2 仪器

LC-10AT高效液相色谱仪(岛津，日本)；C18色谱柱(岛津，LC-C18 150×4.6 mm)；HWS24电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 金银花提取液的制备

称取0.500 g金银花粉末于圆底烧瓶中，加入一定体积分数的乙醇溶液(按照乙醇与水的体积比配制)，80 ℃回流2 h，过滤并转移至离心管中，4 000 r/min离心15 min，收集上清液，用乙醇定容至50 mL容量瓶；再取4 mL，定容至10 mL容量瓶，取适量溶液超声、脱气、过膜后，用高效液相色谱测其浓度。

1.3.2 绿原酸标准溶液的制备

称取2.0 mg绿原酸标准品，50%甲醇定容，即制得浓度为40 μg/mL绿原酸标准溶液。再分别移取标准溶液1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、9 mL定容至10 mL，得到浓度梯度为4 μg/mL、12 μg/mL、20 μg/mL、28 μg/mL、36 μg/mL的绿原酸标准溶液。

2 结果与讨论

2.1 料液比对绿原酸浓度的影响

按照金银花提取液制备的操作步骤，分别以料液比(1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，溶剂为55%乙醇溶液)、提取时间(0.5 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h，2.5 h)、提取温度(50 ℃，60 ℃，70 ℃，80 ℃，90 ℃)、乙醇体积分数(45%，55%，65%，75%，85%，95%)为水平，绿原酸浓度为因子，进行提取率测定。料浆比对金银花中绿原酸浓度的影响见图1。

由图1可见，回流法、超声法其绿原酸的浓度随着料液比的增大呈上升趋势，当料液比为1∶40时均达到峰值。绿原酸在有机溶剂中易溶解，随着提取剂乙醇加入量的增加，被提取物金银花粉末与乙醇的接触面积增大，绿原酸的浓度逐渐升高，当料液比为1∶40时，绿原酸浓度达到饱和。此后，继续增加乙醇的量，绿原酸的浓度会因金银花粉末被稀释而下降。因此，确定料液比为1∶40是提取金银花中绿原酸的最佳比值。

图1 料液比对金银花中绿原酸浓度的影响Fig.1 Effect of material liquid ratio on chlorogenic acid concentration in Honeysuckle

2.2 时间对绿原酸浓度的影响

时间对金银花中绿原酸浓度的影响见图2。由图2可见，随着时间的增长，绿原酸浓度增大，回流法在提取时间为1 h时提取率达到最大。在2～2.5 h处，绿原酸的浓度缓慢增加，且增长幅度较小。而超声法随着时间增长，绿原酸的浓度先缓慢增大后减小，然后再增大，超声时间为2 h时达到最大。超声时间越长，越有利于金银花中绿原酸的溶出。原因分析：最初绿原酸还未完全溶出，随着提取时间的增长，绿原酸逐渐溶出，由于绿原酸的结构不稳定，提取过程中，会发生异构化而使其浓度降低。而超声法比回流法更耗费时间，从节能的角度考虑，回流法更优。

图2 时间对金银花中绿原酸浓度的影响Fig.2 Effect of time on chlorogenic acid concentration in Honeysuckle

2.3 乙醇体积分数对绿原酸浓度的影响

乙醇体积分数对金银花中绿原酸浓度的影响见图3。由图3可见，这两种提取方法不同，得到的绿原酸浓度也不同，但大体趋势是相同的。两种方法在乙醇体积分数为55%时均为最大，之后，绿原酸浓度随着乙醇体积分数的增大先减小再增大。即使75%～85%时，绿原酸的浓度增大，但是它增大之后依旧没有55%高，此后，浓度降低。虽然乙醇体积分数的增大有利于绿原酸的溶出，但当它太大时，绿原酸溶出的同时也会溶出其他物质，这些物质可能与绿原酸产生共沉淀，从而使绿原酸的浓度降低。因此，确定乙醇体积分数55%为提取金银花中绿原酸的最佳值。

图3 乙醇体积分数对金银花中绿原酸浓度的影响Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on chlorogenic acid concentration in Honeysuckle

2.4 温度对绿原酸浓度的影响

温度对金银花中绿原酸浓度的影响见图4。由图4可见，回流法温度为60 ℃时绿原酸浓度最大，此后，随着温度的增高提取率先减小再增大，其增大后程度均没有60 ℃时的高。超声法随着温度的升高，绿原酸的浓度逐渐增大，温度为60 ℃时达到最大。原因分析：温度过低，不利于金银花中绿原酸的溶解；升温，会加快金银花分子扩散，破坏金银花结构，使绿原酸可以更好的溶出。因绿原酸本身不稳定，高温会使其结构里的羧酸基团或邻二酚基官能团产生反应，进而使绿原酸浓度降低。因此，确定温度为60 ℃时为提取金银花中绿原酸的最佳值。

图4 温度对金银花中绿原酸浓度的影响Fig.4 Effect of temperature on chlorogenic acid concentration in Honeysuckle

3 结 论

实验结果表明，超声波法虽然操作简单，但存在提取时间长、提取率低等问题，而绿原酸分子结构含有酯键、不饱和双键、羧酸及苯环等不稳定官能团，温度较高会使其分解，甚至可能会使其它物质溶出，从而造成分离纯化成本增加、提取率下降等影响。回流法具有提取时间短、提取效率相对较高且绿原酸不易被破坏等优点。通过比较以上两种提取方法，不论是饮用金银花茶还是工业提取金银花，回流法相对来说是最好的从金银花中提取绿原酸的方法，同时确定了回流法的提取金银花绿原酸的最佳提取条件。