崔岩岩 梁 倩 向 东 潘永贵 黄午阳 张伟敏 杨 宏

(海南大学食品科学与工程学院1，海口 570228)(江苏省农科院农产品加工研究所2，南京 210014)(华中农业大学食品科学技术学院3，武汉 430070)

迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)系唇形科迷迭香属植物，多年生小灌木，原产于地中海沿岸，在我国贵州、广西、云南、海南、湖南等地大面积引种栽培成功[1]。依据GB 1886.172—2016，迷迭香提取物是以迷迭香的茎、叶为原料，经溶剂(水、甲醇、乙醇、丙酮和/或正己烷)提取或超临界二氧化碳萃取、精制等工艺生产的食品添加剂[2]，作为第三代食用天然抗氧化剂，其主要活性成分为鼠尾草酚、迷迭香酚、迷迭香酸、鼠尾草酸等二萜酚类物质和黄酮等其他高活性成分，并具有高效、安全、广谱、耐热、脂溶性好和抗氧化活性强等诸多优点，而且不会对油炸食品带来不良的风味和影响，其在高温下的高抗异构化活性得到证实(强于茶多酚和TBHQ)[2-7]。鼠尾草酸(Carnosic acid, CA)是迷迭香抗氧化剂中含量最高、活性最强的抗氧化成分，也是目前发现的热稳定性较好的天然脂溶性自由基清除剂，并作为一种食品添加剂越来越被人们所接受[8]。鼠尾草酸的抗氧化性很强，能够清除单线态氧、羟自由基和脂质过氧化氢自由基阻断自由基链式反应，有效阻止脂质过氧化反应[9-11]，提高油脂氧化稳定性的效果远远好于合成类抗氧化剂(PG、BHT、BHA，VE和α-生育酚)[12-16]，其抗氧化能力指数是BHT和VE的3倍，沸点最高达506.4 ℃，不易挥发[5，9，17]。

国内外学者对于TBHQ在常温、高温条件下的抗氧化效果的研究结果表明，TBHQ在常温及高温条件下的抗氧化性能优于其他合成抗氧化剂[18-20]。因此选择TBHQ作为的参照物，评价抗氧化活性强弱。课题组前期通过密度泛函理论计算表明，CA比目前报道的主要不饱和脂肪酸(油酸、亚油酸、亚麻酸和DHA)C-H 解离焓低，表明CA比不饱和脂肪酸双键优先竞争脱氢作为反应底物与氧气结合，从而防止不饱和脂肪酸的氧化，说明它在油脂中是一种十分有效的抗氧化剂，并可以考虑作为TBHQ的替代物。但类似应用中CA对油脂热氧化效果的抑制作用并不清楚，特别是基于油酸甲酯体系探讨鼠尾草酸对热氧化和热致异构化产物抑制作用报道不多。

本研究采用国标法等测定添加鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程(180 ℃)中主要理化特性指标(游离脂肪酸、酸价、过氧化值、茴香胺值和总氧化值)随加热时间变化的影响。运用电子自旋共振仪(ESR)跟踪检测添加鼠尾草酸前后油酸甲酯热加工过程中自由基含量的变化；在主要理化特性测定的基础上，通过HPLC对添加鼠尾草酸前后油酸甲酯热加工过程中主要醛类羰基化合物含量进行检测，探讨鼠尾草酸对油酸甲酯热氧化反应抑制作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

油酸甲酯、鼠尾草酸：纯度99%；特丁基对苯二酚(TBHQ)：纯度98%。其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

754NPC紫外可见分光光度计，HP6890/5975C气相色谱仪，Agilent1100高效液相色谱仪，JES FA200电子自旋共振仪。

1.3 方法

1.3.1 油酸甲酯热处理实验

参照杨美艳[21]的方法，分别将油酸甲酯、添加0.02% TBHQ和0.02% CA的油酸甲酯样品(200 mL)。加入电炸炉中在180 ℃下连续加热12 h。加热过程中分别在0、4、8 h和12 h取20 mL样品，冷却至室温，倒入棕色样品瓶中置于-18 ℃下避光保存。

1.3.2 理化指标测定

参照姬彦羽[2]的方法进行测定。

1.3.3 脂肪酸组成测定

参照姬彦羽[22]的方法进行测定。

1.3.4 自由基变化测定

参照姬彦羽[22]的方法进行测定。

1.3.5 挥发性醛类羰基化合物测定

参考张钰斌[23]的方法进行测定。

1.4 统计学分析

数值以均值±标准偏差形式表示。采用Excel 2007、Origin 8.0及GraphPad Prism 5.0软件对数据进行分析及作图处理。采用SPSS 12.0软件进行显著差异性分析，图表中不同字母表示在P<0.05水平上差异显著，P>0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中理化指标变化的影响

2.1.1 鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中游离脂肪酸与酸价的影响

酸价是评价油脂中游离脂肪酸含量的重要指标。鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中FFA与AV的影响测定结果见图1。由图1可知，未经加热处理的油酸甲酯的FFA和AV差异不显著(P>0.05)，而从第4小时开始产生显著性差异(P<0.05)。油酸甲酯的FFA和AV在整个加热过程中呈上升趋势，添加CA和TBHQ对油酸甲酯热处理过程中的FFA和AV的产生具有显著抑制作用(P<0.05)，而CA和TBHQ的作用效果差异不显著(P>0.05)。此外还可以看出，添加CA对加热后油酸甲酯酸值的升高有较好的抑制作用，实验结果与于文秀等[24]关于不同抗氧化剂对调和油煎炸性能影响研究基本类似。这可能是因为随着加热时间的延长，油酸甲酯的水解反应逐步增强，产生的FFA逐渐增高，进而导致AV升高。

图1 鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中游离脂肪酸(FFA)与酸价(AV)变化的影响

2.1.2 鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中过氧化值的影响

过氧化值(POV)是衡量油脂热氧化过程初期产

物——过氧化物含量多少的关键指标。鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中过氧化值的影响测定结果见图2。由图2可以看出，未经加热处理的油酸甲酯的POV差异不显著(P>0.05)，同样是在第4小时开始产生显著性差异(P<0.05)。但油酸甲酯的POV在整个加热过程中呈先上升后下降的趋势，POV在第8小时达到最高。添加CA和TBHQ对油酸甲酯热处理过程中的POV具有显著抑制作用(P<0.05)，而CA和TBHQ的作用效果在8 h以内差异不显著(P>0.05)，但在12 h则出现了显著性差异(P<0.05)。这可能是CA通过降低过氧化物分解速率从而导致POV下降更为缓慢，即抑制过氧化物快速进入下一阶段氧化反应，进而延缓了油脂的链式反应。研究认为由于氢过氧化物只是油脂热氧化反应中的一个过程产物，氢过氧化物在加热初期会因为热氧化反应而大量产生从而导致POV急速升高，而氢过氧化物很不稳定，又会随着温度升高或者加热时间的延长发生热分解反应而造成POV快速降低，实际上是油脂热氧化过程中氢过氧化物生成速率和分解速率的综合结果[6，22，25，26]。

图2 鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中过氧化值的影响

2.1.3 鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中p-茴香胺值(PAV)的影响

由于氢过氧化物在油脂热氧化反应中后期会发生热分解反应形成醛(己醛和2-己烯醛等)、酮等小分子物质。因而随着反应的持续进行，POV已不能反映油脂氧化的程度。而作为反映油脂热氧化反应后期氧化程度的茴香胺值则可以作为直接反映油脂中醛类物质含量的主要指标之一。鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中PAV的影响见图3。由图3可知，鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中PAV的影响同样是在第4小时开始产生显著性差异(P<0.05)。但是PAV随着加热时间的延长一直呈上升趋势，CA和TBHQ的作用效果差异不显著(P>0.05)。这可能与本实验设计的加热时间过短有关，由于油酸甲酯相对比较稳定，而醛类物质又是热氧化反应后期产物。

图3 鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中p-茴香胺值的影响

2.1.4 鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中总氧化值(TOTOX)的影响

TOTOX值因同时包含了一级氧化产物-氢过氧化物和二级氧化产物-不饱和醛类物质指标而常常被用于评估脂类氧化变质程度[27]。鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中TOTOX的测定结果见图4。由图4可知，未经加热处理的油酸甲酯的TOTOX差异不显著(P>0.05)，同样是在第4小时差异显著性(P<0.05)。但油酸甲酯的TOTOX在整个加热过程中呈先上升后下降的趋势，POV在第8小时达到最高。添加CA和TBHQ对油酸甲酯热处理过程中的TOTOX具有显著抑制作用(P<0.05)，而CA和TBHQ的作用效果在8 h以内差异不显著(P>0.05)，但在12 h则出现了显著性差异(P<0.05)，表明CA和TBHQ能够显著提高油酸甲酯的热氧化稳定性。

图4 鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中总氧化值的影响

2.2 鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中醛类物质组成变化的影响

醛类羰基化合物是油脂在热氧化过程中形成的二级氧化产物的主要成分之一[28]。油脂中醛类及其相关产物的种类及含量与油脂本身特点密切相关，尤其与脂肪酸组成关系密切[29]。油酸在发生氧化分解反应时，容易在双键上的碳原子处(即C9、C10及因电子重排后的C8、C11)生成氢过氧键，从而生成油酸8-、9-、10-和11-COOH经β-均裂裂解后会产生辛烷、庚烷、1-辛醇、庚醇、辛酸、庚酸、1-癸烯、1-壬烯、辛醛、壬醛、癸醛、2-十一烯醛和2-癸烯醛等小分子物质[28-31]。其中主要醛类氧化产物为庚醛、辛醛、壬醛、癸烯醛及十一烯醛。因此主要对来源油酸的辛醛、壬醛、癸醛、反-2-癸烯醛、反-2-十一碳烯醛物质进行分析测定。

2.2.1 鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中醛类羰基化合物总量变化的影响

加入抗氧化剂CA和TBHQ对油酸甲酯180 ℃加热不同时间下5种挥发性醛类羰基化合物总量的影响结果见图5。由图5可知，油酸甲酯加热过程中醛类羰基化合物总量随加热时间的增加而呈逐渐升高趋势。这可能由于醛类物质是中后期氧化产物，而本实验设计加热处理条件温度不是很高、时间不是很长、且油酸甲酯本身相对比较稳定，所以醛类羰基化合物总量随着加热时间延长呈上升趋势。加入抗氧化剂CA和TBHQ对醛类羰基化合物总量抑制效果明显(P<0.05)，其中TBHQ对醛类物质抑制效果略好于CA(P<0.05)。

图5 鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中醛类羰基化合物总量的影响

2.2.2 鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中辛醛变化的影响

加入抗氧化剂CA和TBHQ对油酸甲酯加热过程中辛醛影响结果见图6。由图6可知，油酸甲酯和加入抗氧化剂的油酸甲酯中辛醛含量随加热时间的延长呈先增加后下降的趋势，加热至8 h最高，油酸甲酯(CK)、加入CA油酸甲酯(CA)和加入TBHQ油酸甲酯(TBHQ)中的辛醛含量分别为917.93、366.46、141.24 μg/g。随后逐渐下降，这可能与辛醛的沸点(171 ℃)较低有关，在加热后期，辛醛可能发生了挥发或者分解导致含量减少。加入抗氧化剂CA和TBHQ对辛醛羰基化合物形成抑制效果明显(P<0.05)，其中TBHQ对辛醛抑制效果要略好于CA(P<0.05)。

图6 鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中辛醛的影响

2.2.3 鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中壬醛变化的影响

加入抗氧化剂CA和TBHQ对油酸甲酯加热过程中壬醛影响结果见图7，由图7可知，油酸甲酯和加入抗氧化剂的油酸甲酯中壬醛随加热时间的延长呈先增加后下降的趋势，加热至8 h最高，油酸甲酯(CK)、加入CA油酸甲酯(CA)和加入TBHQ油酸甲酯(TBHQ)中的壬醛含量分别为1 336.95、828.32、254.10 μg/g，随后逐渐下降，这可能与壬醛的沸点(191 ℃)较低有关，在加热后期，壬醛可能发生了挥发或者分解导致含量减少。加入抗氧化剂CA和TBHQ对壬醛羰基化合物总量抑制效果明显(P<0.05)，其中TBHQ对壬醛抑制效果要略好于CA(P<0.05)。

图7 鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中壬醛的影响

2.2.4 鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中癸醛变化的影响

加入抗氧化剂CA和TBHQ对油酸甲酯加热过程中癸醛影响结果见图8。由图8可知，油酸甲酯和加入抗氧化剂的油酸甲酯中癸醛随加热时间的延长呈先增加后下降的趋势，加热至8 h最高，油酸甲酯(CK)、加入CA油酸甲酯(CA)和加入TBHQ油酸甲酯(TBHQ)中的癸醛含量分别为697.76、393.87、290.04 μg/g。随后逐渐下降，这可能与癸醛的沸点(156 ℃)较低有关，在加热后期，癸醛可能发生了挥发或者分解导致含量减少。加入抗氧化剂CA和TBHQ对癸醛羰基化合物总量抑制效果明显(P<0.05)，其中TBHQ对癸醛抑制效果要略好于CA(P<0.05)。

图8 鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中癸醛的影响

2.2.5 鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中反-2-癸烯醛变化的影响

加入抗氧化剂CA和TBHQ对油酸甲酯加热过程中反-2-癸烯醛影响结果见图9。由图9可知，油酸甲酯(CK)与加入CA的油酸甲酯(CA)中反-2-癸烯醛随加热时间的延长呈增加趋势，且加入CA的油酸甲酯中反-2-癸烯醛的增加趋势要高于油酸甲酯，当加入TBHQ油酸甲酯(TBHQ)中反-2-癸烯醛随加热时间延长呈先上升后下降趋势情况，并对反-2-癸烯醛抑制效果显著(P<0.05)。由此可得出，加入CA对油酸甲酯中反-2-癸烯醛的不仅不能抑制其形成反而有促进作用，但具体原因有待于进一步分析，说明TBHQ对反-2-癸烯醛抑制效果要好于CA(P<0.05)。

图9 鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中反-2-癸烯醛的影响

2.3.6 鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中反-2-十一碳烯醛变化的影响

加入抗氧化剂CA和TBHQ对油酸甲酯加热过程中反-2-十一碳烯醛影响结果见图10。由图10可知，油酸甲酯和加入抗氧化剂的油酸甲酯中反-2-十一碳烯醛随加热时间的延长呈逐渐增加趋势，这可能与反-2-十一碳烯醛的沸点(229 ℃)较高，在高温下比较稳定有关。加入CA和TBHQ在8 h以前对油酸甲酯中反-2-十一碳烯醛的形成抑制效果并不明显(P>0.05)，而在12 h时具有显著性差异(P<0.05)，CA效果好于TBHQ，由此说明，抗氧化剂在低温或者加热初期抑制作用并不显著，且CA对油酸甲酯中反-2-十一碳烯醛的抑制效果要强于TBHQ(P<0.05)。

图10 鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中反-2-十一碳烯醛的影响

加入抗氧化剂对油酸甲酯加热过程中的氧化产物—醛类羰基化合物具有良好的抑制效果，且TBHQ的作用效果总体上要优于CA。但两种不同抗氧化剂对不同醛类羰基化合物的抑制作用效果表现并不相同，TBHQ对油酸甲酯在加热过程中辛醛、壬醛、癸醛和反-2-癸烯醛氧化产物抑制效果比CA强，但对反-2-十一碳烯醛的抑制效果则要比CA弱。值得一提的是，CA在油酸甲酯体系对反-2-癸烯醛形成有一定的促进作用，而具体原因并不清楚。

2.3 鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中自由基含量变化的影响

热氧化反应属于自由基链式反应，表征起反应机理最有说服力的方法之一是电子顺磁共振光谱仪(electron paramagnetic resonance, EPR)，又称电子旋转共振(electron spin resonance, ESR)，它是研究油脂热氧化过程中自由基存在最直接和最有效的方法[32-34]。不同自由基形成的 ESR 谱图不同，ESR的信号强度(峰高值)可表示样品在共振条件下所吸收的总能量，且自由基含量(数目)与信号强度(峰高值)成正比。因而，根据不同自由基形成的 ESR 谱图不同和信号强度(峰高值)能够实现对自由基的定性和定量分析[35，36]。

添加抗氧化剂CA和TBHQ油酸甲酯的ESR图谱测定结果见图11，添加抗氧化剂的ESR谱图的峰型非常相似，均为裂分的三重峰(即六重峰)，这可能与采用PBN捕获的不同自由基加合物的谱图通常十分相似，且谱图多为自由基的混杂，难于区分和鉴别分子结构特征。综合谱图的g值为 2.001 8，接近于自由电子的g值2.003 0，符合自由基的基本特性，其超精细耦合分裂常数为αN=14.7 G，αH=20.7 G，属于多种碳中心自由基混杂的结果[20，22，37]。油酸甲酯(CK)与添加CA和TBHQ油酸甲酯的信号强度随加热时间的延长呈上升趋势，其中加入CA的油酸甲酯的信号强度随加热时间变化较小，TBHQ次之，油酸甲酯最大。说明油酸甲酯的自由基的含量随加热时间延长呈增加趋势，加入CA和TBHQ对油酸甲酯自由基含量的产生有显著抑制效果，其中CA效果优于TBHQ。

图11 鼠尾草酸对油酸甲酯热加工过程中自由基变化规律的影响

3 讨论

鼠尾草酸对FFA、AV和自由基的抑制作用效果略好于TBHQ，其原因可能是在热诱导脂质氧化过程中，油脂发生热水解反应形成游离脂肪酸、甘油一酯和甘油二酯等热水解反应产物，不饱和脂肪酸在O2和高温作用下，顺式双键易脱氢形成自由基而发生自由基链式反应，生成脂肪酸ROOH，而ROOH不稳定易发生β均裂反应，产生大量醛、酮、酸、醇等小分子(相对于原不饱和脂肪酸)热氧化降解反应产物等。可以看出，游离脂肪酸与自由基的形成均发生在油脂氧化的起始阶段，由此可以推断出，在油脂热氧化反应起始阶段，CA抗氧化作用效果要略好于TBHQ，在传播反应与终止反应作用效果则稍差，鼠尾草酸对FFA、AV和自由基的抑制作用效果略好可能与两者的作用阶段不同有关。由此可以得出，除了常规理化指标之外，醛类羰基化合物和自由基含量可以作为衡量不饱和脂肪酸加热过程中品质变化的重要指标，加入抗氧化剂可以提高油酸甲酯的热氧化稳定性。且鼠尾草酸可以考虑作为TBHQ的替代物。这可能与鼠尾草酸与TBHQ的结构类似，均为二酚类的抗氧化剂、且都有两个活性羟基，因而鼠尾草酸具有很强的抗氧化活性，可与TBHQ媲美。

4 结论

本研究的油酸甲酯样品主要理化指标(FFA、AV和PAV)在加热过程中随加热时间延长均呈逐步增加趋势，而POV和TOTOX在整个加热过程中呈先上升后下降的趋势。加入抗氧化剂能够显著降低油酸甲酯样品中的FFA、AV、POV、PAV和TOTOX值(P<0.05)，其中CA对油酸甲酯FFA、AV的抑制作用效果略好于TBHQ，而在其他理化指标方面则稍逊于TBHQ。

加入抗氧化剂对油酸甲酯加热过程中的氧化产物—醛类羰基化合物具有良好的抑制效果。CA和TBHQ对不同醛类羰基化合物的抑制作用效果表现并不相同，TBHQ对油酸甲酯在加热过程中辛醛、壬醛、癸醛和反-2-癸烯醛氧化产物抑制效果比CA强，但对反-2-十一碳烯醛的抑制效果则要比CA弱。总体而言，TBHQ的作用效果总体上要优于CA。

本研究是油酸甲酯样品中自由基含量随加热时间延长均呈持续升高趋势，其中未加入抗氧化剂油酸甲酯升高趋势要显著高于加入抗氧化剂的油酸甲酯，而CA比TBHQ对油酸甲酯中自由基含量的抑制效果更为明显。