丁亚杰，李朝燕，冯振，周韦利，赵爱光

(上海中医药大学附属龙华医院肿瘤一科，上海 200023)

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，预后差，病死率居恶性肿瘤的第三位，5年总生存率仅10%～21%；胃癌的根治手段是手术切除，胃癌手术后40%～60%的患者出现复发转移[1-2]。晚期胃癌的预后差，接受最佳支持治疗的晚期胃癌患者总生存期仅为4.3个月[3]。因此，胃癌的早期诊断及早期治疗至关重要。病理诊断为胃癌诊断的金标准，但由于胃癌的异质性以及活检的有创性，病理诊断已不能满足日益发展的肿瘤精准治疗的需要。而作为新一代“液体活检”技术的血浆循环肿瘤 DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)检测，因具有微创、可重复性等优势，在肿瘤的诊断、治疗及预后检测等方面发挥重要作用[4-6]。ctDNA可用于胃癌的早期诊断和临床分期、疗效评价和预后判断以及转移和复发风险的评估。肿瘤异质性与耐药性研究在胃癌的临床研究中起重要作用。现就ctDNA在胃癌中的研究进展予以综述，旨在为临床的推广应用提供新思路。

1 ctDNA的生物学特性

循环游离DNA是一种胞外的DNA，以单链或双链DNA、DNA蛋白质复合物等形式存在于血液、脑脊液等体液中[7]。1948年，Mandel和Meatis[8]首次发现人体血液中存在游离形式的DNA，它是由坏死或凋亡的细胞释放的[9]。研究表明，循环游离DNA的浓度在自身免疫性疾病、心肌梗死、肿瘤、妊娠状态中增加[10]。ctDNA是体液中循环游离DNA的一种，是仅由肿瘤细胞释放的携带有肿瘤特异性遗传学改变的自由基因组片段，ctDNA来源于肿瘤原发灶、转移灶和循环肿瘤细胞等，释放机制包括凋亡、坏死及分泌等，其中以凋亡释放为主[11]。ctDNA的片段一般为170 bp，其半衰期为16 min至2.5 h[12]。ctDNA包含易位、缺失和扩增导致的基因组重排，以及表观遗传学的DNA变化，而DNA的变化与肿瘤的发生发展密切相关。

2 ctDNA的检测方法

为了提高ctDNA检测的灵敏度和特异度，肿瘤的特异性基因和肿瘤表观遗传学改变相关的分子标志物已经应用于ctDNA的血浆样本检测。肿瘤特异性的基因和表观遗传畸变已被用作血液样品中ctDNA的标志。在胃癌中，低甲基化和高甲基化启动子区被广泛用于检测血清中的ctDNA。染色体重排可以使用高灵敏度的重排特异性聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，但需要原发性肿瘤的全基因组测序以寻找潜在的异常靶点[13-14]。低覆盖基因组测序检测拷贝数变化应用于无原发肿瘤基因组信息的ctDNA检测，这种检测的成功需要高水平的ctDNA[15]。ctDNA中常见的标志是点突变，包括替换、插入、缺失，通常采用选择性PCR检测，数字PCR可检测结构变异(如拷贝数的变化)，其与点突变具有相似的灵敏度，每个反应的特定点突变数量有限[16]。

二代测序(next generation sequencing，NGS)为ctDNA定性分析提供了可靠的手段。NGS可以对数百万个序列各异的DNA分子同时进行测序，并将这些DNA分子片段的序列进行拼接和组装，形成基因组信息；同时也能检测出低频突变，除快捷和低成本外，其对突变的检测具有更高的灵敏度。此外，NGS还可以对基因拷贝数变化、基因重排、基因融合等改变进行分析。测序前对目标基因进行特异性PCR扩增后再测序，以提高测序的准确度，如TAm-Seq、Safe-SeqS等方法[17]。有研究者通过检索肿瘤基因突变数据库寻找非小细胞肺癌复发突变相关外显子，再从肿瘤基因图谱库的全基因组测序结果进行筛选，又被称为个体化深度测序(CAPP-Seq)[18]。

ctDNA检测受到循环中存在的野生型DNA的影响，因此需要肿瘤特异性标志物和高灵敏度的方法，不同的研究方法见表1。

3 胃癌中ctDNA的研究

组织活检仍是肿瘤诊断的金标准，但存在许多不足：①存在与侵入性取样相关的风险，特别适用于脆弱的器官(如肺部肿瘤)，由于灵敏度不高，经常导致无法检测早期肿瘤；②因为肿瘤的异质性和不断变化，以组织活检为基础的检查常不能准确判断肿瘤进展情况[10-12]。ctDNA的半衰期<2 h，而蛋白质标记的半衰期血浆可以持续数周。ctDNA能在接受治疗的患者中更准确地反映肿瘤的实时负荷。

表1 ctDNA的常见检测方法

3.1ctDNA在胃癌早期诊断中的应用 胃癌的早期诊断在胃癌的治疗中具有重要作用。评估特定基因的DNA甲基化是早期诊断胃癌的一种方法。甲基化导致肿瘤抑制基因的转录失活与胃癌的进展有关，因此检测抑癌基因的甲基化可用于胃癌的早期诊断。Pimson等[25]检测了202例胃癌患者血浆ctDNA中原钙黏蛋白10和Ras相关区域家族1A基因的甲基化发现，与正常组相比，胃癌组患者血浆中这两个基因的甲基化突变频率增高，且这两个基因甲基化突变的患者预后较差和复发转移率较高，故得出原钙黏蛋白10和Ras相关区域家族1A基因甲基化可作为胃癌血液中潜在的非侵入性诊断指标，用于胃癌的早期诊断。Balgkouranidou等[26]应用甲基化特异性PCR检测73例可手术的胃癌患者血清中SOX17(sry like high-mobility group box 17)的甲基化水平，结果显示在43例胃癌患者血清中检测到SOX17启动子甲基化，而健康人血清样本中的SOX17启动子均未发生甲基化；且分析发现，SOX17甲基化具有较短的总生存期。该研究提示，对抑癌基因SOX17进行甲基化水平检测可用于胃癌的早期诊断。

3.2ctDNA在胃癌治疗中的作用

3.2.1预测预后 早期发现胃癌的复发转移，同时在靶向治疗过程中及时发现个体基因的水平变化对胃癌的治疗和预后至关重要。在胃癌的治疗过程中，可通过检测血浆ctDNA水平的变化，及时诊断，预测患者的预后，评价靶向药物的疗效。Hamakawa等[27]对晚期胃癌患者血浆ctDNA中的肿瘤蛋白p53(tumor protein p53,TP53)基因进行检测，同时监测3例患者的TP53水平与临床预后的关系，结果发现TP53水平升高与不良预后密切相关；且手术后TP53 ctDNA的突变水平降低，而术后发生复发转移的患者TP53的ctDNA突变水平升高。该研究通过检测TP53基因的突变情况，分析判断TP53基因突变水平与胃癌患者的不良预后相关，提示ctDNA可用于动态监测胃癌疾病的进展。Shoda等[28]对胃癌患者血浆ctDNA中人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)拷贝数进行检测，研究纳入60例接受手术的胃癌患者和30例健康志愿者，其中17例胃癌患者出现复发转移；使用RPPH1(Ribonuclease P RNA component H1)作为参考基因，HER2/RPPH1定义为HER2的比值，结果显示，术前血浆HER2比值与肿瘤组织的HER2状态相关(P<0.001)，其灵敏度和特异度分别为0.733 和0.933；术后随访分析发现，在17例复发转移病例中，4例组织样本检测HER2阴性，13例组织样本检测HER2阳性，其中7例HER2阳性患者血浆HER2比值较HER2阴性原发肿瘤患者高，提示肿瘤进展过程与HER2扩增相关，但随着疾病的进展，血浆HER2水平呈进行性升高。该研究通过重复和无创性检测血浆ctDNA中HER2的水平，实时评估HER2阳性患者胃癌治疗的效果，提示HER2的水平与患者的预后相关，并对手术HER2阴性的初始患者在疾病复发时出现HER2状态转变的治疗方案进行指导，克服了病理检测不能在疾病治疗中实时检测HER2表达的问题。

3.2.2基因分型和个性化辅助治疗 基因分型在精准化治疗中发挥重要作用。近年来，随着基因测序技术的发展，对胃癌分子分型的研究报道逐渐增加。癌症基因组图谱收集295例未放化疗胃癌患者的组织和血样，进行6种分子平台检测，提出4种胃癌分子分型，即EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)阳性型、微卫星不稳定(microsatellite instability，MSI)型、基因稳定型和染色体不稳定型[29]。另一项研究中，亚洲癌症研究协作组发表了基于亚洲胃癌患者标本的分型，采用多项NGS技术将患者的遗传特征进行分类，并分析了其与预后的关系；研究者根据病理标本中MSI上皮-间充质转化和TP53的情况将胃癌分为MSI、微卫星稳定(microsatelite stability，MSS)/上皮-间充质转化、MSS/TP53+和MSS/TP53-四种亚型，其中MSI亚型预后最好，多为肠型；MSS/TP53+型的预后较好；MSS/TP53-型预后较差，并多合并TP53突变；MSS/上皮-间充质转化多为弥漫型，印戒细胞癌，突变率低，早期发病[30]。深入了解不同胃癌病例分子层面的内在差异，可以更精准地判断预后，并选择相应的治疗方案，是提高胃癌疗效的关键之一。基因分型旨在分析遗传突变，在癌症治疗中起着重要作用，尤其在免疫治疗中。目前临床实践中可通过从组织中获取DNA进行基因分型，但组织活检只能获得局部和静态肿瘤的信息，无法反映实时肿瘤由于异质性和不断进化而进行的基因分型[31-32]。而ctDNA检测则克服了这一问题，可以反映整个肿瘤的基因突变组织，且来自同一患者的ctDNA可以使用不同的阶段来动态监控肿瘤进展期间发生的基因突变[33]。基于ctDNA的液体活检可能改善肿瘤基因分型和肿瘤的靶向治疗，这将更加优化胃癌的治疗。Kim等[34]对61例胃癌患者进行ctDNA和组织分子分型的检测，将患者按MSI-H和EBV的阳性情况分组，患者均采用细胞程序性死亡配体1阳性的派姆单抗进行治疗，同时用有73个基因的NGS对ctDNA进行检测，结果发现，血浆ctDNA水平升高和ctDNA正常患者的无病生存期分别为66 d和123 d，疾病控制率分别为25%和92%，客观缓解率分别为58%和0；在ctDNA高突变负荷的患者中，MSI-H和EBV阳性患者对派姆单抗具有很高的反应率，且细胞程序性死亡配体1阳性与EBV+/MSI-H具有很高的相关性。因此，采用ctDNA液态活检技术能够监测靶向治疗过程中的疗效，为患者随时调整用药。Wang等[14]通过监测胃癌患者血浆ctDNA水平，指导应用曲妥珠单抗的治疗，并对56例服用曲妥珠单抗患者的组织样本和血浆HER2水平进行检测，结果显示在26例患者中检测到HER2表达，而且在肿瘤组织和血浆中，HER2的扩增具有高度一致性，提示ctDNA检测可以替代组织样本，用以筛选HER2靶标人群；同时该研究还发现，ctDNA中HER2拷贝的变化可有效监测曲妥珠单抗的疗效，曲妥珠治疗有效时，血液中HER2拷贝数变化早于肿瘤标志物癌胚抗原和糖类抗原19-9，提示ctDNA可用于临床实践中监测患者对靶向药物曲妥珠单抗的疗效。Du等[35]基于NGS的ctDNA技术发现，胃癌患者在克唑替尼治疗过程中组织和血浆的ctDNA突变有相似的突变谱；同时发现在肿瘤组织和血浆ctDNA中均有间质表皮转化因子(mesenchymal to epithelial transition factor，MET)和重组人成纤维细胞生长因子受体2(recombinant human fibroblast growth factor receptor 2，FGFR2)的扩增、抑癌基因APC和TP53拷贝数丢失以及抑癌基因APC-R216X、TP53-L111R、APC-K1444 FS等突变失活，这些基因的突变可能是患者发生肿瘤进展的机制。该研究初步通过连续监测血浆ctDNA水平，预测患者对克唑替尼的耐药性，同时说明了克唑替尼耐药的分子机制，并证明了ctDNA图谱分析在治疗决策和预后中的巨大潜力。

3.3克服胃癌异质性 肿瘤细胞在增殖过程中基因型可能会发生变化，即使是在同一肿瘤组织内部，不同细胞也可能存在不同的基因分型。在整个肿瘤治疗过程中，伴随着细胞增殖与药物压力选择，肿瘤细胞也会出现不同的分子分型演进。肿瘤异质性存在空间和时间的二维变化的异质性。肿瘤精准诊疗的主要思想是基于肿瘤进化论的发现，肿瘤进化论的核心内容是肿瘤异质性，包括个体之间的肿瘤异质性和瘤体内肿瘤细胞间的异质性。因此，克服胃癌的异质性是实现精准治疗的关键。Catenacci等[36]研究了胃癌原发肿瘤和转移淋巴结中MET基因和FGFR2基因拷贝在空间上的异质性发现，胃癌经5-氟尿嘧啶/顺铂治疗后发生腹膜转移，且FGFR2基因扩增仅限于原发肿瘤，MET基因扩增仅限于腹膜转移病灶。胃癌经MET单抗治疗后复发转移，血浆ctDNA中的KRAS基因拷贝数表达发生改变，可能是出现耐药的原因；研究者通过检测血浆ctDNA的MET、FGFR2、KRAS基因拷贝数变化，分析预测胃癌发生复发转移的可能分子机制，用于指导MET单抗的靶向用药。Gao等[37]采用NGS技术对30例晚期胃癌患者肿瘤相关基因的ctDNA和组织样本进行测序，分析血浆和组织中共有的突变，包括TP53、成纤维细胞生长因子14、Smad4和磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚基α基因，结果发现，肿瘤组织与血浆的ctDNA基因水平差异有统计学意义；与组织切片相比，ctDNA中的突变大多数均在配对的肿瘤组织中检测到，ctDNA具有较高浓度的HER2扩增，提示ctDNA未来可成为组织检测的替代物。可见，基于ctDNA的技术评估可以部分地克服肿瘤异质性，并可能作为胃癌HER2分析的潜在替代物。

4 小 结

ctDNA作为一种非侵入性、方便、精确的诊断方法已越来越多地应用于临床[38]，是一种很有前景的生物标志物，在胃癌的诊断、预后及疾病的管理和控制方面发挥着重要作用。ctDNA可以实时反映肿瘤组织的分子情况，相对于组织活检，ctDNA更能代表整个机体的肿瘤情况[39]。然而，目前很少有研究准确地报道患者复发或死亡的敏感性和特异性，同时对ctDNA生物标记是否为复发或存活的独立预测因子的报道也较少。此外，各个研究对ctDNA处理方法以及检测分析方法的不同均会影响检测结果。总之，ctDNA在胃癌的诊断、治疗以及预测复发转移方面起重要作用，有望进一步完善后广泛应用于临床。