房艳 *，高俊海 ，于思雨

1. 谱尼测试集团股份有限公司（北京 100095）；2. 谱尼测试集团北京科学技术研究院有限公司（北京 100095）

鸡蛋因含有丰富的营养物质而备受大众青睐，市售鸡蛋一般分为自然放养或较大范围圈养的鸡产蛋（土鸡蛋）和人工饲料笼养的鸡产蛋（洋鸡蛋），此外也不乏有机鸡蛋、富硒鸡蛋等概念蛋。相关研究资料表明，土鸡蛋在蛋黄比例、类胡萝卜素、蛋白质、胆固醇等指标与洋鸡蛋具有明显差异，且大多数往往在表征上体现为蛋黄颜色更深[1-3]。随着我国经济水平的不断提高，人们对鸡蛋品质的要求也越来越高。在利益的驱使下，不法商贩通过在饲料中超量添加斑蝥黄等着色剂，人为加深鸡蛋蛋黄色泽，以增加感官效果及经济效益。

斑蝥黄（Canthaxanthin，C40H52O2）又称角黄素，属于类胡萝卜素，是加丽素红的有效成分[4-5]，呈橙红色，可通过家禽消化道吸收并最终富集于蛋黄[6-7]，是一种较为常用的饲料添加剂。然而，相关研究结果表明斑蝥黄被人体吸收后可能会在视网膜蓄积造成视力减退等[8]，且具有一定的肝损伤性。因此，欧盟规定饲料中斑蝥黄的添加量不得高于25 mg/kg[9]，日本于2006年实施的肯定列表制度中也规定禽蛋等动物源性食品中角黄素最大残留量为100 μg/kg[10]。

目前，鸡蛋中斑蝥黄的检测方法主要有液相色谱法[11-15]、超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）法[16-18]等。此次试验拟利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF）技术建立一种分辨率更高的斑蝥黄定性检测方法，对生鸡蛋和熟鸡蛋进行同步分析，并与标准方法SN/T 2327—2009《进出口动物源性食品中角黄素、虾青素的检测方法》中UPLC-MS/MS部分的检测结果进行比较。

1 材料与方法

1.1 仪器、设备与试剂

Waters Xevo G2-XS QTOF/UPLC系统（配备二极管阵列检测器PDA，美国Waters公司）；LC-20AD高效液相色谱仪-LCMS-8045质谱仪（日本岛津公司）；T18均质机（德国IKA公司）；Vortex-Genie 2涡旋振荡器（美国Scientific IN.D.ustries公司）；CT15RT高速冷冻离心分离机（中国上海天美生化仪器设备工程有限公司）；N-1100旋转蒸发仪（日本东京理化器械株式会社）；Millipore-Q超纯水净化仪（美国Millipore-Q公司）；AB135-S分析天平（感量0.1 mg，瑞士METTLER TOLEDO公司）；DZKW-4恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）；KH-500E超声清洗器（中国昆山禾创超声仪器有限公司）；滤膜（尼龙，0.22 μm，美国Agela Technologies公司）。

斑蝥黄标准物质（纯度95%，CAS 517-78-3，中国计量科学研究院）；正己烷（色谱级，纯度≥95%，CAS 110-54-3，Hipure chem公司）；正丙醇（分析纯，西陇化工股份有限公司）；无水硫酸钠（分析纯，西陇科学股份有限公司）；2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT，纯度99.8%，美国Thermo Fisher公司）；乙酸铵（分析纯，西陇科学股份有限公司）；甲酸（分析纯，西陇科学股份有限公司）；亮氨酸脑啡肽（分析纯，美国Waters公司）；乙腈（质谱级，美国Honeywell Inernational公司）；UPLC-QTOF流动相用水（质谱纯，霍尼韦尔贸易（上海）有限公司）；除UPLC-QTOF流动相用途之外的水皆为超纯水，经Millipore-Q超纯水净化仪制备；乙腈提取剂（0.25 g BHT溶解于500 mL乙腈）；BHT-乙腈溶液（0.5 g BHT溶解于500 mL乙腈）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备

取蛋黄并记录蛋黄颜色（罗氏比色扇法），混匀。其中，取部分为生鸡蛋试样；取部分煮熟后用均质机充分捣碎、混匀，为熟鸡蛋试样。

1.2.2 样品前处理

称取约1 g（精确至0.01 g）试样于50 mL离心管中，加入15 mL乙腈提取剂及10 g无水硫酸钠，涡旋混匀，在35 ℃以下水浴超声提取10 min，以3 000 r/min离心5 min。将上清液移入预置有20 mL正己烷的分液漏斗中，振摇后静置分层；收集下层乙腈相，正己烷相在分液漏斗，待试样后续脱脂重复使用。按上述步骤对离心管中的残留物用10 mL乙腈提取剂重复提取，所得提取液用上述正己烷相脱脂。合并2次脱脂后所收集的乙腈相，加入5 mL正丙醇，在40 ℃以下旋转蒸发浓缩至近干，用乙腈溶解并定容至5.0 mL，经0.22 μm滤膜过滤，滤液待测。

1.2.3 标准溶液的制备

准确称取斑蝥黄标准物质，用BHT-乙腈溶液溶解并稀释，制备成质量浓度在0.1～200 ng/mL范围的标准工作液，供UPLC-QTOF和UPLC-MS/MS分析。以定量离子对的峰面积为纵坐标，相应的质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，保留时间和碎片离子定性，外标法定量。

1.2.4 仪器条件

1.2.4.1 UPLC-QTOF条件

色谱柱，Acquity UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；进样体积，2 μL；流速，0.3 mL/min；柱温，30 ℃；流动相，乙腈（A）和含0.2%甲酸的5 mmol/L的乙酸铵溶液（B）；梯度洗脱，0～3.4 min，90%～98%（A）；3.4～3.8 min，98%～90%（A）；3.8～5.0 min，90%（A）。

电喷雾离子源（ESI），正离子扫描，MS/MS模式；离子源温度，115 ℃；脱溶剂气温度，340 ℃，氮气；脱溶剂气流速，750 L/h；锥孔气流速，45 L/h，氩气；毛细管电压，3.0 kV；锥孔电压，20 V；碰撞能30 V；四极杆低质量数分辨率，15；实时校正液，亮氨酸脑啡肽（正离子条件m/z 556.277 1）。

1.2.4.2 UPLC-MS/MS条件

色谱柱，Agilent Eclipse Plus C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；进样体积，2 μL；流速，0.4 mL/min；柱温，40 ℃；流动相，乙腈-0.1%甲酸溶液（92︰8，V/V），等度洗脱5 min。

电喷雾离子源（ESI），正离子扫描，多反应监测（MRM）；离子源温度，300 ℃；雾化气、加热气、干燥气，氮气；碰撞气，氩气；雾化气流量，180 L/h；加热气流量，600 L/h；干燥气流量，600 L/h；DL温度，250 ℃；加热模块温度，400 ℃；毛细管电压，3.0 kV；检测器电压，1.74 kV；监测离子对及相关MRM参数见表1。

表1 斑蝥黄的MRM参数

2 试验结果

2.1 QTOF结果分析

QTOF具有极高的分辨率[（FWHM）＞40 000]，可检测组分并收集精确质量数母离子和碎片离子。相比于UPLC-MS/MS精确化合物质荷比至小数点后2位，QTOF可至小数点后4位且质量精度仍＜10-6，具有极高的可靠性和稳定性。QTOF分析结果表明，在正离子模式下，斑蝥黄的一级质谱以准分子离子峰m/z 565.404 5[M+H]为基峰，主要碎片离子为m/z 133.067 6和m/z 203.146 0，且上述两碎片离子的产生方式如图1所示。同时，其它碎片离子还包括m/z 185.135 5，157.103 0，119.083 3和215.144 9等，且全部碎片情况均与将斑蝥黄的化学结构式导入MassLynx并按偏差3 mDa和最可能断键方式等条件筛选后输出的结果相对一致，具体信息见表2。

图1 斑蝥黄QTOF质谱图

表2 斑蝥黄碎片信息表

2.2 标准曲线及谱图

斑蝥黄在UPLC-QTOF条件下峰形良好，保留时间为2.69 min，见图2。在0.1～200 ng/mL浓度范围内线性良好，线性方程为Y=6 244.3X-4 779.3，R2=0.999 4，见图3。

图2 斑蝥黄标准溶液UPLC-QTOF谱图（100 ng/mL，RT 2.69 min）

图3 QTOF条件下斑蝥黄标准曲线

2.3 样品测定

样品预处理及UPLC-MS/MS条件参考SN/T 2327—2009。选取4种蛋黄颜色不同的鸡蛋样品，利用UPLC-QTOF和UPLC-MS/MS对生鸡蛋（F）和熟鸡蛋（C）试样进行同步分析，相关结果见表3。

试验结果表明，所有样液的谱图中均具有分离度较高且保留时间与斑蝥黄标准物质偏差在±5%以内的目标峰，且目标峰的碎片离子精确质荷比及其丰度与斑蝥黄标准物质基本一致，定性结果与标准方法[14]完全相同，说明该方法适用于定性检测鸡蛋中的斑蝥黄，且该方法的测定低限也与标准方法[14]（0.1 mg/kg）相同。同时，在定量方面，除斑蝥黄含量低于0.01 mg/kg的试样外，UPLC-QTOF和UPLC-MS/MS分析试样时的相对偏差在2.7%～5.5%之间；当斑蝥黄含量低于0.01 mg/kg时，对应的样品溶液质量浓度接近0.1 ng/mL最低定量浓度，相对偏差在1.4%～19.4%之间；但两种方法的检测结果均相对一致，且均能相对准确地反映鸡蛋中斑蝥黄的含量水平，在一定程度上说明该方法可以作为鸡蛋中斑蝥黄质量控制的有效辅助手段。

表3 UPLC-QTOF和UPLC-MS/MS的测试结果

3 结论

利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF）技术，建立了一种斑蝥黄的定性检测方法。该方法具有较高的灵敏度，与标准方法相当。相比于UPLC-MS/MS，QTOF可实现精确化合物质荷比至小数点后4位且质量精度仍小于10-6，具有极高的可靠性和稳定性，并可以同时识别更多碎片离子，便于更准确的定性研究。此次试验为鸡蛋中斑蝥黄的检测提供了一种高分辨率的检测技术，对于蛋品的市场监管具有重要意义。