戴富才，赵丽艳，曹祥铭，肖立伟，景学敏

廊坊师范学院化学与材料科学学院（廊坊 065000）

胎菊（Foetus chrysɑnthemum）是杭白菊的一种，是尚未完全开放的杭白菊[1]。胎菊能散风清热、平肝明目、清热解毒。胎菊中含有多种有效成分，如挥发油、黄酮类物质、绿原酸、多糖类、3, 5-O-双咖啡酰基奎宁酸等 。绿原酸是胎菊中一种重要成分，具有抗病毒、抗氧化、抗衰老、调节免疫、降糖、增加白细胞数量等多种生理作用[2]。

绿原酸（Chlorogenic acid）是一种有机酸，分子式为C16H18O9，易溶于乙醇、甲醇、丙酮等极性溶剂，在乙酸乙酯中微溶，在氯仿、石油醚、苯等亲脂性溶剂中难溶[3]。近几年，绿原酸在人们的生活中被广泛使用，我们平时用的绿原酸主要有两个来源：一是人工合成，这种方法目前还不太成熟，应用较少；二是从天然产物中提取，主要集中在金银花[4-6]、杜仲[7-8]等天然产物上。市场上绿原酸供应不足，导致绿原酸价格居高不下。所以扩大绿原酸的提取来源并研究其提纯工艺就十分有必要了。胎菊中绿原酸的含量较高，可以作为提取绿原酸的原料，而从胎菊中提取绿原酸的研究不多[9]。因此，如何从胎菊中分离出高纯度的绿原酸产品，成为研究的焦点。

研究采用超声波粗提-大孔树脂纯化-萃取分相-聚酰胺柱层析分离-产品结晶的方法，从胎菊中得到纯度较高的绿原酸产品。结合标准品，对胎菊绿原酸产品进行表征，并计算产品的产率和纯度，为胎菊中绿原酸的应用提供一些理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料与试剂

胎菊（产地浙江），云南楷林中药饮片有限责任公司；绿原酸标准品（纯度为98%），武汉天植生物技术有限公司；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、磷酸（优级纯），天津渤化化学试剂有限公司；溴化钾（光谱纯），上海麦克林生化有限公司；DMSO-d6（含量为99.9%），上海麦克林生化有限公司；NKA-9大孔树脂、聚酰胺粉、浓盐酸、无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚、氢氧化钠，分析纯。

1.2 主要仪器设备

Agilent 1260型高效液相色谱仪，Agilent科技有限公司；Ascend™ 400高场核磁共振波谱仪，德国BRUKER公司；DZF-6050MBE真空干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；KQ-250B超声波清洗器，上海之信仪器有限公司；RE-52A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；XFB-400高速中药粉碎机，湖南吉首市中湘制药机械厂；TD4低速台式离心机，湖南仪器仪表总厂；酒精计，河北省武强红星玻璃仪表厂；离子交换柱（直径32 mm，长300 mm），天津市天玻玻璃仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 胎菊粗提液的制备

取胎菊粉碎，过20目筛，待用。

将30.0 g的样品放入500 mL的锥形瓶中，并参考文献[10]条件对胎菊中绿原酸进行粗提取，即60%的乙醇溶解，pH为2，料液比为1∶14（g/mL），在80 W，50℃超声提取50 min。重复上述步骤提取滤渣，合并2次滤液。将滤液浓缩至无醇味（用酒精计测量的乙醇体积分数约为2%），在4 ℃放置24 h，离心（3 000 r/min，离心10 min），上清液即为胎菊粗提液。

1.3.2 大孔树脂对胎菊绿原酸的初步分离

1.3.2.1 大孔树脂的预处理

参照文献[10]预处理NKA-9大孔树脂，活化备用。

1.3.2.2 大孔树脂初步分离胎菊中的绿原酸[11]

将处理好的NKA-9大孔树脂，用湿法装柱，将其装入离子交换柱粗柱，柱高15 cm左右，将胎菊粗提液在大孔树脂中进行过柱，上样液浓度为0.022 mg/mL，吸附pH 3，上样液体积为12 BV，控制吸附流速3 BV/h，以4 BV的30%乙醇溶液为解吸液，控制解吸流速3 BV/h左右。用锥形瓶收取分离液，减压浓缩至无醇味（酒精计测得乙醇体积分数为2%）待用。

1.3.3 乙酸乙酯萃取、石油醚分相进一步分离胎菊中的绿原酸

将大孔树脂纯化后的粗品溶液用水调节pH在2左右，转移至分液漏斗中，加乙酸乙酯进行萃取，粗品溶液与萃取剂的体积比为1∶2，萃取2次后，将乙酸乙酯相合并。乙酸乙酯相加分相剂石油醚，体积比为4∶1，收集水相[12]。

1.3.4 聚酰胺树脂纯化胎菊中绿原酸

1.3.4.1 聚酰胺树脂的预处理

参照文献[10, 13]预处理聚酰胺树脂，活化备用。

1.3.4.2 聚酰胺进一步纯化绿原酸

使用湿法装柱的方式，将聚酰胺树脂进行装柱，控制柱高15 cm，将经1.3.3萃取分相后的水相样品溶液浓缩（浓度尽量大，以不析出晶体为准），加于聚酰胺柱顶，控制上样量在0.5 BV左右，先用pH为3的盐酸水溶液2 BV冲洗除杂，然后分别用10%乙醇2 BV、30%乙醇4 BV作为解吸液梯度洗脱，收集30%乙醇4 BV解吸液，备用。

1.3.5 乙酸乙酯重结晶精制胎菊中的绿原酸

纯化聚酰胺树脂后，将30%的解吸液减压浓缩，直到出现大量晶体。冷藏24 h后，将晶体减压过滤，并用乙酸乙酯重结晶[10,14]，即可得胎菊绿原酸产品。1.3.6 胎菊中的绿原酸的高效液相色谱分析

1.3.6.1 色谱条件

色谱柱为SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相，色谱纯乙腈-0.1%磷酸水溶液（各体积随时间变化见表1）；流速，1.0 mL/min，柱温，25 ℃；检测波长，327 nm；进样量，10 μL[10]。

表1 乙腈与0.1%磷酸水溶液的体积比随时间变化表

1.3.6.2 标准品溶液的配制

参照文献[10]，在棕色容量瓶中，用50%色谱纯甲醇，配制质量浓度为0.2 mg/mL的绿原酸标准溶液。4 ℃左右冰箱保存，待用。

1.3.6.3 绿原酸标准曲线的绘制

参照文献[15]，取绿原酸标准溶液，配制成0.01，0.02，0.03，0.04，0.05和0.06 mg/mL的标准品工作液。用高效液相色谱法在327 nm处测定峰面积。以峰面积为纵坐标，绿原酸质量浓度为横坐标，得到一元线性回归方程：y=35 993.84x-11.916，相关系数R=0.998 8。表明绿原酸的浓度在0.01～0.06 mg/mL范围内呈良好的线性关系，可根据标准曲线法进行定量分析。

1.3.6.4 供试品溶液

参照文献[10]，在棕色容量瓶中，用50%色谱纯甲醇，配制质量浓度为0.2 mg/mL的绿原酸产品溶液。4 ℃左右保存，待用。

1.3.7 胎菊中绿原酸的紫外-可见光谱分析

取少量绿原酸标准品、胎菊绿原酸产品，用50%色谱纯甲醇溶解，进行紫外可见光谱表征。

1.3.8 胎菊中绿原酸的红外光谱分析

取少量绿原酸标准品、胎菊绿原酸产品，用干燥的溴化钾分别进行压片，进行红外光谱表征。

1.3.9 胎菊中绿原酸的核磁共振氢谱分析

取适量绿原酸标准品、胎菊绿原酸产品，以DMSO-d6为溶剂，进行核磁共振氢谱表征。

1.3.10 胎菊绿原酸产品产率的计算

准确称取200.000 g胎菊，按照最佳工艺纯化，所得产品充分干燥，准确称其质量，代入式（1），计算产率[16]。

式中：Y为胎菊绿原酸的产率，%，m为胎菊绿原酸产品质量，g；G为所用胎菊干粉质量，g。

1.3.11 胎菊绿原酸产品纯度的计算

按照1.3.6小节，将0.2 mg/mL的胎菊绿原酸产品和0.2 mg/mL的绿原酸标准品在相同的液相色谱条件下，进行高效液相色谱分析，记录绿原酸峰面积，代入式（2）计算产品纯度。

式中：P为胎菊绿原酸产品的纯度，%；A为胎菊绿原酸产品的液相色谱峰面积，mAU·s；As为绿原酸标准品的液相色谱峰面积，mAU·s。

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱分析

图1 液相色谱图

由图1a可知，绿原酸标准品保留时间为6.076 min，与胎菊粗提液（图1b）绿原酸位置为6.074 min大致相等，因此可以确定胎菊提取液中含有绿原酸，但是杂质峰较多。经NKA-9大孔树脂提纯（图1c），溶液变为澄清，除去了大部分杂质峰。乙酸乙酯萃取石油醚分相后（图1d），绿原酸纯度进一步提高，左侧杂质峰消失，这是因为乙酸乙酯萃取出大部分极性大于绿原酸的杂质；而石油醚分相过程又除掉极性小于绿原酸的杂质[12]。聚酰胺纯化后（图1e），绿原酸附近的杂质峰明显减少，因为用pH为3的酸水冲洗时，绿原酸电离被抑制，大部分吸附在聚酰胺树脂上，而大部分杂质则被冲洗下去，梯度解吸能最大程度地纯化胎菊中绿原酸。乙酸乙酯重结晶后（图1f），几乎看不到杂质峰，绿原酸产品的纯度很高。

2.2 紫外-可见光谱表征

由图2可以看出，绿原酸标准品（图2a）和绿原酸产品（图2b）的出峰位置几乎相同，在327 nm左右有最大吸收峰，与文献[17]的结果相同，进一步表明产品为绿原酸。

图2 紫外-可见光谱图

2.3 红外光谱表征

由绿原酸标准品（图3a）和胎菊绿原酸产品（图3b）的红外光谱图可知，绿原酸产品与标准品吸收峰位置大致相同，绿原酸产品的主要吸收峰列于表2。由光谱分析可知，测定结果与图4绿原酸的化学结构式一致，以上数据进一步验证该产品为绿原酸[18-20]。

图3 红外光谱图

表2 胎菊中绿原酸产品的红外光谱分析

图4 绿原酸化学结构式[10, 21]

2.4 核磁共振氢谱表征

由图5b可知，胎菊绿原酸产品的化学位移及对应图4中氢的位置分别为：δH 7.42（1H，d，J=16.0 Hz，H-7´），δH 7.04（1H，d，J=2.0 Hz，H-2´），δH 6.99（1H，dd，J=8.2 Hz，2.0 Hz，H-6´），δH 6.77（1H，d，J=8.0 Hz，H-5´），δH 6.15（1H，d，J=16.0 Hz，H-8´），δH 5.04-5.09（1H，m，H-3），δH 3.92（1H，brs，H-5），δH 3.56（1H，brs，H-4），δH 1.75-2.05（4H，m，H-2，H-6）。结果表明：胎菊绿原酸产品和绿原酸标准品的化学位移几乎一致，以上数据进一步验证产品为绿原酸[10,21]。

图5 核磁共振氢谱

2.5 胎菊中绿原酸的产率

试验所用胎菊干粉质量为200.000 g，纯化后胎菊绿原酸产品质量为36 mg，将数据代入式（1），计算得产率为0.018%。

2.6 胎菊中绿原酸的纯度

在相同的液相色谱条件下，胎菊绿原酸产品（图1f）的液相色谱峰面积为7 761.58 mAU·s，绿原酸标准品（图1a）的液相色谱峰面积为7 860.63 mAU·s，将数据代入式（2），计算得胎菊绿原酸产品的纯度为98.7%。

3 结论与讨论

3.1 结论

研究将胎菊中绿原酸进行提取、纯化，建立了一套高效的纯化工艺：将胎菊粉碎，超声提取得粗提液，经大孔树脂初步提纯，乙酸乙酯萃取、石油醚分相，聚酰胺柱色谱分离，乙酸乙酯重结晶得产品；经过高效液相色谱、紫外-可见光谱、傅里叶变换红外光谱、核磁共振氢谱技术分析得产品为绿原酸，产率为0.018%，经液相色谱定量计算，其纯度可达98.7%。

3.2 讨论

用聚酰胺纯化胎菊中绿原酸，梯度洗脱时，最初用pH为3的酸水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇各2 BV解吸。用pH为3的酸水冲洗时，绿原酸电离被抑制，大部分绿原酸吸附在聚酰胺树脂上，而色素等水溶性杂质则被冲洗下去；10%乙醇解吸时，液相色谱显示仍有少量水溶性杂质，40%乙醇洗脱时，则有较多极性小于绿原酸的杂质，而20%乙醇和30%乙醇洗脱时，经液相色谱峰面积计算，纯度都在95%以上。因此，为保证产品纯度，并简化纯化步骤，10%乙醇解吸后，直接用4 BV 30%乙醇解吸，收集此段解吸液，进行进一步重结晶纯化处理。