李建功，麦喆钘，李雪山△，罗川晋，李俊哲

(1. 中山市中医院内一科，广东 中山 528400； 2. 广州中医药大学，广州 510405)

心肌缺血再灌注损伤是指心肌组织在较长时间心肌缺血后恢复血流灌注，反而出现比灌注前更明显、更严重的功能损伤和组织障碍[1-2]。目前，该病的防治策略主要包括浅低温治疗、补充抗氧化剂等[3]。中医药防治心肌缺血再灌注损伤是当今的研究重点[4-6]。

黄蛭口服液的功效为活血逐瘀、行气化浊，在临床常被用于高血压、高血脂症、冠心病等治疗[7-8]。黄蛭口服液由大黄、水蛭、牛蒡子组成[9-10]。研究显示，黄蛭口服液能显著上调单核巨噬细胞ABCA1的水平[11]，明显减少心律失常的发生率，减少血清丙二醇的产生，增加超氧化物歧化酶的含量[12]，在降低患者超敏C反应蛋白、低密度脂蛋白、脑钠肽水平方面有一定的辅助作用[13-14]。黄蛭口服液作为中成药制剂，具有“多成分、多靶点、多途径”的特点。但目前大多研究仅停留于药物对个体和个别分子的影响，其治疗心肌缺血再灌注损伤的有效活性成分及作用机制尚不明确。而对于黄蛭口服液，仍未有任何相关网络药理学研究。本研究采用网络药理学方法，分析黄蛭口服液的化学成分、作用靶标、信号通路，揭示黄蛭口服液的多靶标、多通路协同作用，从而发现新的治疗靶点和通路，为临床治疗心肌缺血性再灌注损伤提供新思路。

1 资料与方法

1.1 药物化学成分和活性成分的获取

通过检索中国系统药理学平台(http://lsp.nwu.edu.cn/，TCMSP)获取大黄和牛蒡子的化学成分，通过检索文献资料获取水蛭的化学成分，再于TCMSP平台检索所有化学成分的信息，包括分子名(Molecule Name)、分子量(MW)、口服生物利用度(OB)、血脑屏障(BBB)、类药性(DL)等。结合毒药物动力学评价标准，设置OB值≥40%和DL值≥0.18为筛选条件[15]，从所有化学成分中筛选出活性成分。

1.2 黄蛭口服液活性成分预测靶标的获取

将所有活性成分的3D结构图通过软件Chembiodraw Ultra 12.0绘制出来，并上传至DRAR-CPI服务器(http://cpi.bio-x.cn/drar/)。基于反向分子对接原理，得到各活性成分与所有蛋白的结合亲和力分数(Z-score)。本团队选取分数小于-0.5的蛋白作为黄蛭口服液的预测靶标。并通过UniprotKB数据库(https://www.uniprot.org/)中获取各预测靶标的基因符号及其Uniprot ID。

1.3 心肌缺血再灌注损伤相关靶标基因获取

以“myocardial reperfusion injury”和“myocardial ischemia reperfusion injury”为关键词分别从Genecards数据库(https://www.genecards.org/)和DisGeNET数据库(http://www.disgenet.org/)中检索出与心肌缺血再灌注损伤相关的蛋白，结合2个数据库的检索结果作为本次研究的疾病靶标。

1.4 活性成分-疗效靶标网络构建与分析

取活性成分预测靶标与疾病靶标两者的交集，作为黄蛭口服液治疗心肌缺血再灌注的疗效靶标。将疗效靶标及其对应的活性成分导入软件Cytoscape 3.5.1，构建出活性成分-疗效靶标网络。

1.5 疗效靶标相互作用网络构建与分析

将所有疗效靶标的Uniprot ID导入String数据库，限定物种条件为“Homo sapiens”，获取疗效靶标之间的蛋白相互作用关系(Protein-protein interactions，PPI)，并利用软件Cytoscape 3.5.1绘制出PPI网络图，并使用NetworkAnalyzer工具对网络图进行统计，得出各疗效靶标的degree值(连接度)，即各靶标可相互作用的靶标数。挑选出degree值最大的5个疗效靶标作为核心靶标。

1.6 分子对接与分析

将上述5个核心靶标导入System Dock Web Site 服务器(http://systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index)，按照服务器原始参数的设定，进行核心靶标与活性成分之间的分子对接，得出对接评分(Docking score)，并通过柱状图的方式展示结果。通过该评分评价成分与和核心靶标之间的结合潜力。

1.7 分子功能与通路分析

利用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对疗效靶标进行基因本体(Gene ontology，GO)富集分析和基于京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)的通路富集分析，再选取GO分析结果中的分子功能(Molecular Function)部分和KEGG分析结果中通路(KEGG PATHWAY)部分进行讨论。筛选出P值小于0.05和富集基因数较大的前20条通路与分子功能。筛选结果通过OmicShare网站(http://www.omicshare.com/)绘制的高级气泡图展示。

1.8 药物-活性成分-潜在靶标-通路网络构建

通过文献资料，从20条通路中再筛选出与心肌缺血再灌注相关的通路作为重要通路。再将与重要通路对应的疗效靶标以及作用于疗效靶标的活性成分，导入Cytoscape 3.5.1绘制“药物-活性成分-疗效靶标-重要通路”网络图，阅图分析黄蛭口服液的治疗机制及特点。

2 结果

2.1 黄蛭口服液的活性成分

按照步骤1.1本团队筛选到13个活性成分，其中大黄有5个，水蛭有5个，牛蒡子有3个，包括大黄酸(rhein)、决明内酯(Toralactone)、水蛭素(hirudin)、森林山蛭素(haemadin)、牛蒡子苷(arctiin)。

2.2 心肌缺血再灌注损伤潜在作用靶标预测

表1示，按照步骤1.2及1.3本研究共获得活性成分预测靶标126个和疾病靶标1156个，最后得到疗效靶标76个。

2.3 成分-靶标关系网络的构建

图1示，按照步骤1.4绘制出活性成分-疗效靶标网络图。图1共含有节点86个，包括13个八边形的活性成分节点(内圈)以及73个椭圆形的疗效靶标节点(外圈)；边线120条，代表13个活性成分与73个疗效靶标之间共有120种作用关系。由此可见，黄蛭口服液治疗心肌缺血再灌注损伤是通过复杂网络关系而非简单的单一成分作用单一靶标来发挥作用的。

图1 活性成分-疗效靶标网络

表1 黄蛭口服液活性成分表

2.4 潜在靶标相互作用网络构建

图2示，按照步骤1.5得到73 个疗效靶标之间的PPI网络图。由此可见，73个疗效靶标之间有着复杂的关联，这提示黄蛭口服液不仅是因为作用于多个靶标发挥治疗作用，还可因为多个疗效靶标之间的相互调节影响。同时本团队发现，在黄蛭口服液治疗心肌缺血再灌注损伤中发挥较大作用的5个核心靶标分别是ALB、AKT1、TNF、CASP3、JUN。

图2 疗效靶标相互作用网络

2.5 分子对接

图3示，按照步骤1.5对活性成分和核心靶标进行分子对接，得到对接评分结果。Docking score值大于7.0的成分有15个(23.1%)，Docking score值在5.0到7.0之间的有24个(36.9%)，在4.25到5.0之间的成分有17个(26.2%)，而Docking score值小于4.25 的成分仅有9个(13.8%)。综上，黄蛭口服液的活性成分与核心靶标具有良好的结合活性。

图3 分子对接结果

2.6 GO分类富集分析和KEGG通路富集分析

图4、5示，按照步骤1.7得到GO分析和KEGG分析结果，其中P<0.05且富集靶标较多的分子功能有protein binding、enzyme binding等；P<0.05且富集靶标较多的生物通路有PI3K/AKT、TNF、p38MAPK、HIF-1等信号通路。

图4 潜在作用靶标的MF分析

2.7 药物-活性成分-潜在靶标-通路网络构建

图6示，按照步骤1.8本研究筛选到5条重要通路，分别是HIF-1 pathway、p38MAPK pathway、TNF pathway、PI3K/AKT pathway和Apoptosis。据此绘制出药物-活性成分-疗效靶标-重要通路网络图，其中六边形节点代表重要通路，圆形节点代表疗效靶标，三角形节点代表活性成分，矩形节点则为药物。由图可知，黄蛭口服液治疗心肌缺血再灌注损伤是利用多成分作用于多靶点，影响多通路来发挥作用的。

图6 “药物-活性成分-疗效靶标-重要通路”多维网络关系图

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤是常见的心血管疾病，需要引起临床医生的重视。研究发现，黄蛭口服液可降低脑钠肽前体，同时还可提高PCI术后左室射血分数，是治疗再灌注损伤的首选药物之一[16-17]。本研究利用网络药理学原理，通过对各个数据库的挖掘和检索，构建出“药物-活性成分-疗效靶标-重要通路”网络，对黄蛭口服液治疗心肌缺血再灌注损伤的作用机制进行了初步探讨。

研究发现，黄蛭口服液主要通过13个活性成分发挥治疗作用，包括大黄酸(rhein)、水蛭素(hirudin)、牛蒡子苷(arctiin)等。现代药理学研究发现，大黄酸具有清除活性氧且明显减少心肌缺血后产生毒物对心肌细胞的损害[18]。林冠宇[19]等研究发现，中低剂量的水蛭素可以通过增加VEGF蛋白合成以激活Notch通路，促进人微血管内皮细胞增殖和微血管再生，加快缺血损害组织的恢复。Zhang[20]等发现，牛蒡子苷可抑制脂多糖诱导中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和白蛋白等分泌过程，减少炎症发生，降低炎症对缺血心肌细胞的损害。

通过检索这73个疗效靶标的相互作用关系，结合文献阅读，本研究认为AKT1、TNF、JUN等靶标在治疗心肌缺血再灌注损伤中发挥最广泛的作用。李东野[21]等研究发现，AKT1基因可以通过促进抑凋亡基因Bcl-2的表达，同时抑制促凋亡基因Bax的表达，通过两方面的作用抑制心肌细胞凋亡。还有研究认为，抑制JUN基因的转录也可以阻断细胞凋亡反应的发生[22]。再者减少TNF-α的释放也可以通过抑制细胞凋亡有效减轻心肌缺血再灌注损伤[23]。因此我们认为，黄蛭口服液主要是通过抑制心肌细胞凋亡产生疗效，具体可能是减少PCI术后活性氧等对有毒害作用物质的产生。核心靶标与13个活性成分分子对接结果显示两者结合活性良好，充分说明本研究采用的方法学具有较好的科学性，结果与客观事实比较接近，故此基础上进行构建网络并分析，能为临床使用或进一步科学研究提供有价值的指导。

GO分析结果提示，黄蛭口服液可能通过影响蛋白结合功能起到治疗心肌缺血再灌注损伤的作用。脂联素受体结合蛋白是脂联素受体1 的一个关键结合蛋白[24]，两者的结合可以介导脂联素在多种细胞中产生信号传导作用，促进脂联素对缺血再灌注损伤心肌的保护[25-26]，所以黄蛭口服液很有可能通过促进不同蛋白的相互结合，从而发挥治疗心肌缺血再灌注损伤的作用。

根据KEGG分析结果，结合文献查阅，本研究认为HIF-1通路、p38MAPK通路、PI3K/AKT通路和细胞凋亡在治疗心肌缺血再灌注损伤中发挥着较重要的作用。低氧诱导因子(HIF-1)能在低氧下激活多种靶基因的转录，HIF-1通路是机体在缺氧状态下调节各器官生化反应的重要通路[27]。其中HIF-1α可以通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，减少大鼠心肌缺血再灌注损伤后炎症的发生[28]，而且可以上调血管内皮生长因子及其受体的分泌与合成，有助于缺血组织血供的恢复[29]。p38MAPK通路参与心肌缺血再灌注、心室重构等的发生[30-31]。而且研究发现，p38MAPK信号通路抑制剂可以改善心肌缺血再灌注损伤[32]。PI3K/AKT通路主要起到激活细胞和调控蛋白质代谢的生物作用。AKT可以在PI3K/AKT通路中发挥中间环节的作用，调节众多的下游通路，不仅可直接作用于Bcl-2家族，促进细胞凋亡，同时还可以激活eNOS通路，减少氧化损伤，对心肌缺血再灌注后诱发的心肌损伤有关键的调节作用[33]。

综上所述，本研究从黄蛭口服液的活性成分、疗效靶标和重要通路入手，初步探讨黄蛭口服液的治疗机理，主要包括减少缺血后有细胞毒作用产物的生成，减轻炎症对细胞的损害作用以及抑制心肌细胞的凋亡，同时促进缺血组织的血供恢复。但其结果还显示，黄蛭口服液可能通过乙肝病毒感染通路、结肠癌的发展来治疗心肌缺血再灌注损伤，与现代研究大流方向不尽相同，但也说明黄蛭口服液治疗疾病在体内起到多方面的调节作用。鉴于网络药理学的局限性，本研究存在一点片面性，仍需后续的具体研究进一步验证。