焦健

摘 要：本研究通过分离纯化获得一种新的黄曲霉真菌病毒，并对该真菌病毒的基本基因组序列信息进行比对分析，研究带毒菌株的生长状况及其后代中黄曲霉毒素B1（AFB1）的产生情况。结果发现，该真菌病毒不但可以影响黄曲霉菌的生长，而且还可以影响AFB1的产生。

关键词：真菌;真菌病毒;真菌毒素;抑制作用

中图分类号：S-3       文献标识码：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200930004

引言

真菌病毒（Fungal virus或Mycovirus）是侵染真菌并在真菌中复制的病毒，普遍存在于自然界中。目前所发现的真菌病毒多数属于RNA病毒，但在核盘菌中曾报道一种DNA病毒，即SsHADV-1。大多数病毒感染真菌后不表现感染特征，对寄主没有显著影响，常不易发现;但也有一些真菌病毒对寄主的表型具有显著的抑制作用，如引起植物病菌真菌致病力衰退现象。目前，在已发现的弱毒力真菌病毒中已有部分进行了序列分析，如RnMBV1、CHV1、RVM2、DPRV、FgV-1、HvV190S、SsDRV和SsHADV-1。这些真菌病毒为植物真菌病害的防治及病原真菌的分子生物学特性研究提供了新的契機。

目前所发现的真菌病毒多为RNA病毒，根据其基因组类型分为双链RNA（dsRNA）病毒和单链RNA（ssRNA）病毒，也有一些dsDNA病毒。根据核酸类型、病毒粒体有无、病毒粒体形状等分类依据，可将目前发现的dsRNA真菌病毒分为黄绿病毒科、双分病毒科、呼肠孤病毒科、全病毒科和低毒病毒科等;而ss（+）RNA真菌病毒分别归属于杆菌状核糖核酸病毒科和裸露病毒科等，分布于寄主线粒体中的病毒称之为线粒体病毒（Mitovirus）。

植物真菌病害会对农作物的产量及品质造成严重影响，而且在作物生长和粮油产品储藏过程中，可分泌多种对人畜有害的代谢物，对农产品的产量及安全都造成了一定程度危害。目前，农作物真菌病害主要依赖化学防治，这种方法不可避免地会产生环境污染及农药残留等问题。所以，生物防治因其对环境的友好性而备受关注，真菌病毒可作为防控病原真菌的生物防治途径之一。目前研究发现，致病力衰退相关的真菌病毒可用于植物病害的生物防治，其中低毒病毒（Hypovirus）与板栗疫病病菌（Cryhonectria parasitica）的互作系统是真菌病毒与寄主互作研究的经典模式。本研究以分离黄曲霉真菌病毒为切入点，旨在利用真菌病毒直接防控黄曲霉毒素的形成。

1 材料与方法

1.1 病毒dsRNA提取

称取0.3g菌丝（干重），在液氮下研磨成粉，转移至2mL离心管中。在离心管中依次加入2×GPS 500μL，苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）1000μL，10% SDS 115μL，室温充分震荡10min。4℃ 12000rpm离心8min，取上清600μL至1.5mL离心管（需事先加好纤维素粉）。在1.5mL离心管中加入0.04g左右的CF-11纤维素粉，114μL的100%乙醇（每100μL上清需加19μL100%乙醇），震荡混匀后冰浴20～30min;4℃12000rpm离心1min，弃上清，加入600μL清洗缓冲液，震荡混匀，室温静置3min，再离心、清洗2次;4℃12000rpm离心2min，弃上清，尽量不使管壁上残留液体，然后加入640μL 1×STE，震荡混匀5min;4℃ 12000rpm离心5min，取上清600μL至干净的1.5mL离心管中，加入1/10体积的3M NaAC（pH5.2）和0.8～1.0倍体积的异丙醇，-20℃沉淀2h以上;4℃ 12000rpm离心20min，弃上清，用800μL预冷的75%乙醇清洗2次，再用500μL 100%乙醇清洗1次，离心弃上清，沉淀于超净台吹风干燥。加入40μL DEPC水溶解备用（可用50℃水浴助溶）。

1.2 实验试剂

Malt Extract Agar（1L）：30g Malt Extract，3g Peptone，15g Agar;2×GPS：甘氨酸15.0g，Na2HPO414.2g，NaCl35.1g，用NaOH调pH值为9.6，加DEPC处理的H2O定容至1L;10×STE：0.5 M Tris，1 M NaCl，10 mM EDTA，pH8.0，DEPC处理H2O配制;清洗缓冲液：1×STE中加入无水乙醇使乙醇终浓度为15%;TE：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，灭菌，使用时加入RNaseA至20ng·mL-1;10×TBE：Tris 108g，硼酸55g，0.5 M EDTA 40mL加入ddH2O定容至1L;10%SDS：在900mL水中加入100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加水定容至1L，分装备用，无需灭菌;Na3PO4缓冲液（pH7.0）：1000mL中含0.2 M Na2HPO4溶液（mL）610mL，0.2 M NaH2PO4溶液（mL）390mL;Na3PO4缓冲液（pH7.4）：1000mL中含0.2M Na2HPO4溶液（mL）810mL，0.2M NaH2PO4溶液（mL）190mL。

CF-11纤维素粉为Sigma公司产品，其它各种化学试剂为国产分析纯。所有离心管和枪头都需DEPC处理。

2 结果与分析

2.1 黄曲霉真菌病毒的分离纯化和基因组序列比对

本研究首先分离真菌病毒的dsRNA，对提取的样品（YT5）进行DNase I和SI核酸酶酶切后电泳检测，发现1条大小约为1000bp的条带。电泳样品在经过DNase I和SI核酸酶酶切后仍然可以看到清晰的条带，因此可断定其为dsRNA，即为黄曲霉真菌病毒基因组。

采用随机引物合成cDNA，对合成的cDNA进行A-Tailing后与载体相连接，转化大肠杆菌，挑选阳性克隆进行培养后提取质粒，挑取含有较大插入片段的质粒进行序列测定及分析，其长度为855bp。NCBI Blast结果显示重组质粒为曲霉属真菌病毒dsRNA基因组的cDNA片段。

通过将得到的黄曲霉菌真菌病毒的氨基酸序列与其它曲霉属真菌病毒的氨基酸序列进行比对，发现本研究中黄曲霉菌真菌病毒的氨基酸序列与已公布的黄曲霉菌真菌病毒及臭曲霉真菌病毒的氨基酸序列存在较高的保守型，其序列同源性约为34.88%。系统进化树分析表明，本研究中黄曲霉菌真菌病毒的氨基酸序列与已公布的黄曲霉菌真菌病毒178a和178b的氨基酸序列保守型约为46%。

2.2 真菌病毒对黄曲霉菌生长及其产毒的影响

研究真菌病毒对黄曲霉菌生长速度的影响，对带毒菌株与不带毒菌株生长速度测定数据显示，带毒菌株较不带毒菌株生长速度更为缓慢，通过对生长1d、3d、5d和7d后的菌斑直径的测量，带毒菌株较不带毒菌株的菌斑直径明显变小（图1、图2）。

通过检测AFB1的产生，发现携带dsRNA真菌病毒的后代中，AFB1的产量明显下降（图3）。这些证据表明，真菌病毒不但可以影響黄曲霉菌的生长，而且还可以影响其AFB1的产生。

2.3 低毒力菌株在农业生产中的防控应用效果

利用携带真菌病毒的低毒力菌株或者弱毒力菌株，可以有效抑制正常菌株的生长，从而降低感染农作物的菌株的繁殖、扩增以及其所分泌的真菌毒素的影响。为此，先分离后代中带有真菌病毒的低毒力菌株，以便后续开展实际的生物防控应用。

本研究通过带毒菌株病毒的垂直传染分析，采用单孢子分离的方法，随机挑选带毒菌株后代100个单孢子进行病毒dsRNA检测。结果表明，后代中含病毒的有76个（76%），不含病毒的有24个（24%），且出现分化，通过检查黄曲霉毒素产生量，发现后代带毒菌株的AFB1明显低于不带毒菌株。

此外，还开展了带毒菌株与不带毒菌株的菌丝融合实验。通过对比培养带毒菌株与不带毒菌株，发现带毒菌株与不带毒菌株的菌丝不能随着生长而融合，出现了营养不亲和现象，而且带毒菌株的生长速度和菌丝生产量明显高于不带毒菌株（图4），可为低毒力菌株在农业生产中的防控应用提供基础。通过选取低毒力菌株与农田中（土壤和花生植株）实际取得的样本菌株（均经检测选取产毒素菌株）进行联合对峙培养，发现约有83%的对峙培养实验表现出带毒菌株的生长速度和菌丝生产量明显高实际菌株，表现出很好的生物防控应用效果。

3 结语

真菌病毒是指寄生于各种真菌中的病毒，其中部分弱毒相关病毒可使寄主真菌致病力发生衰退，甚至导致病原群体致病力下降，是一种具有生防潜能的微生物资源。真菌病毒未来的研究方向可从以下方面着手：采用宏转录组等技术鉴定和发掘更多的真菌病毒;通过遗传转化手段或挖掘可利用的化学物质或传播介体提高病毒的传播效率;建立遗传转化体系及病毒反向遗传转化系统，结合多组学手段深入研究病毒与寄主真菌互作[1]。

利用植物病原真菌病毒进行植物真菌性病害的生物防治应用，可以从产生低毒力的菌株、代谢物致死植物病原真菌及其保护作用3个方面考虑。在利用真菌病毒防治植物真菌病害方面，最经典的是通过寄生板栗疫病菌的弱毒相关真菌病毒防治欧洲板栗疫病的蔓延，是弱毒相关真菌病毒在生物防治应用上的成功例证。然而，由于真菌病毒通常缺少细胞外的传播途径，只能通过孢子释放进行垂直传播或通过感染菌株与未感染菌株间的菌丝融合进行水平传播，营养体不亲和性成为限制弱毒相关病毒传播和生物防治效率的最主要因素。在多种植物病原真菌中发现新的真菌病毒，这些弱毒性的真菌病毒为防治作物真菌病害提供了可能，以期通过研究者的不懈努力获得毒性低、亲和性范围广、传递低毒性强并且能适应自然的工程菌株[2]。

本研究分离得到一种黄曲霉真菌病毒，并通过初步试验发现，利用该真菌病毒可有效抑制黄曲霉毒素的形成。并且，通过低毒力菌株与农田中样本菌株的联合对峙培养，发现带毒菌株的生长速度和菌丝生产量明显高于实际菌株，表现出很好的实际生物防控应用效果。

参考文献

[1] 李春霞，李敏，高兆银，弓德强，洪小雨，姜瑛，常圣鑫，胡美姣.刺盘孢菌真菌病毒研究进展[J].南方农业学报，2020，51（01）：123-132.

[2]刘忱，皮磊，舒灿伟，周而勋.低毒真菌病毒在植物病害生物防治中的研究及应用进展[J].分子植物育种，2018，16（02）：552-559.

（责任编辑  周康）