李德新　李华　李飞　赵晓晨　李茂德　安祥　兰戴天

摘要：目的  探讨不同程度CDCA5表达在裸鼠肝细胞癌中的作用及临床价值。方法  取HepG2正常细胞组、CDCA5低表达组、CDCA5高表达组、HepG2肝癌细胞株，将高表达组、低表达组CDCA5高效转染人肝癌HepG2细胞，并设阴性对照组（NC组）。免疫印迹法检测转染24 h后各组CDCA5蛋白的表达水平，CCK-8法检测转染24、48、72、96、120 h 各组细胞的增殖能力，Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测低表达组转染48 h的凋亡情况;将HepG2正常细胞组，CDCA5低表达组的细胞分别注射于裸鼠成瘤，观察成瘤时间，第30天处死小鼠，观察瘤体状态。免疫组化检测CDCA5在裸鼠肿瘤中的表达。结果  高表达和低表达组的CDCA5蛋白水平均高于NC组（P<0.05）;自转染48 h起，高表達组和低表达组的相对增殖率均高于NC组（P<0.05）;高表达组和低表达组转染72 h后的相对增殖率分别为（130.03±0.35）%和（70.10±1.04）%，均高于其他观察时间点（P<0.05）;低表达组转染48 h的早期和晚期凋亡率均高于NC组（P<0.05）;裸鼠皮下注射普通HepG2细胞组及CDCA5低表达HepG2细胞，瘤体重量分别为（0.93±0.06）g、（0.69±0.10）g，差异有统计学意义（P<0.05）;CDCA5在低表达组裸鼠肿瘤组织中表达降低。结论  CDCA5能促进HepG2癌细胞的增殖，可通过调控CDCA5表达水平，有效抑制肝癌细胞的增殖并促进其凋亡。

关键词：CDCA5;肝癌;裸鼠;预后

中图分类号：R735.7                                 文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.18.015

文章编号：1006-1959（2020）18-0048-03

The Role and Clinical Value of CDCA5 in Nude Mice Hepatocellular Carcinoma

LI De-xin，LI Hua，LI Fei，ZHAO Xiao-chen，LI Mao-de，AN Xiang，LAN Dai-tian

（Sichuan Academy of Medical Sciences/Hepatobiliary Surgery，Sichuan Provincial People's Hospital，

Chengdu 610010，Sichuan，China）

Abstract：Objective  To explore the role and clinical value of different levels of CDCA5 expression in nude mice hepatocellular carcinoma.Methods  HepG2 normal cell group， CDCA5 low expression group， CDCA5 high expression group and HepG2 hepatocarcinoma cell lines were selected. The high expression group and low expression group CDCA5 were efficiently transfected into human liver cancer HepG2 cells， and a negative control group （NC group） was established. Western blotting was used to detect the expression level of CDCA5 protein in each group after 24 h of transfection. CCK-8 method was used to detect the proliferation ability of cells in each group after transfection 24， 48， 72， 96， 120 h. Annexin V-FITC/PI double label flow Cytometry was used to detect the apoptosis of the low expression group for 48 h after transfection; the HepG2 normal cell group and the CDCA5 low expression group were injected into nude mice to form tumors， and the tumor formation time was observed. The mice were killed on the 30th day and the tumors were observed body state. Immunohistochemistry was used to detect the expression of CDCA5 in tumors of nude mice.Results  The CDCA5 protein levels of the high and low expression groups were higher than those of the NC group （P<0.05）; since 48 h after transfection， the relative proliferation rates of the high and low expression groups were higher than those of the NC group （P<0.05）; The relative proliferation rates of high expression group and low expression group 72 h after transfection were （130.03±0.35）% and （70.10±1.04）%， respectively， which were higher than other observation time points （P<0.05）; low expression group was transfected the early and late apoptosis rates at 48 h were higher than those in the NC group （P<0.05）; the nude mice were subcutaneously injected with ordinary HepG2 cells and CDCA5 low-expressing HepG2 cells， and the tumor weights were （0.93±0.06） g and （0.69±0.10）g， the difference was statistically significant （P<0.05）; the expression of CDCA5 in the tumor tissues of nude mice in the low expression group decreased.Conclusion  CDCA5 can promote the proliferation of HepG2 cancer cells， and could effectively inhibit the proliferation of liver cancer cells and promote their apoptosis by regulating the expression level of CDCA5.

Key words：CDCA5;Liver cancer;Nude mice;Prognosis

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是临床常见的恶性肿瘤，患者就诊时往往病情严重、预后较差，病死率高，目前主要以手术治疗、放疗、化疗、生物治疗等综合治疗为主[1]。研究发现，肿瘤的发生与细胞周期具有重要的相关性，对肿瘤细胞周期异常蛋白的调控成为治疗靶点。CDCA5在多种肿瘤组织中表达均增加[2-4]，这提示CDCA5在肿瘤的发生及发展过程中可能起到重要的作用。本研究通过CDCA5细胞实驗、裸鼠成瘤实验，探讨低表达CDCA5在肝癌细胞中的功能，试图寻找生物治疗新的方向提供参考。

1材料与方法

1.1主要试剂与仪器  收集HepG2正常细胞组，CDCA5低表达组，CDCA5高表达组，HepG2肝癌细胞株，DMEM 高糖培养基，10%胎牛血清和25%胰蛋白酶，小鼠抗CD-CA5抗体，小鼠抗GAPDH抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体，电泳、电转装置，BCA蛋白定量试剂盒购，免疫印迹化学发光剂，ECL流式细胞仪，慢病毒pSICOR、pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro，DNA凝胶回收试剂盒，青链霉，PBS，碘化丙啶，菌种DH5α由本实验室保存。

1.2细胞培养  SMMC-7721、HepG2细胞 用含有10%胎牛血清及1%青链霉素的DMEM培养基置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，0.25%胰蛋白酶消化传代培养，行转染实验。

1.3实验动物  SPF级BAlB/C-nu/nu裸小鼠，4～6周龄，体重18～20 g，购自四川省医学科学院实验动物研究所，在SPF级动物房内饲养。

1.4 Western blotting检测各组CDCA5蛋白表达水平  细胞转染24 h后提取高表达组、低表达组、NC组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，将蛋白浓度调整为2 μg/μl，取30 μg蛋白上样，SDS-PAGE 凝胶电泳（5%浓缩胶60 V×40 min，10%分离胶100 V×60 min），4 ℃200 mA恒流转膜1 h，室温封闭1 h，分别加CDCA5一抗（1∶1000）、GAPDH一抗（1∶2000），4 ℃过夜，二抗（1∶5000）室温孵育1 h。将PVDF膜置于 ECL中反应，于凝胶成像系统中曝光，采集图像，应用Quantity one进行灰度分析，蛋白相对表达量用CDCA5灰度值与内参 GAPDH 的比值计算。

1.5 CCK-8 法检测细胞增殖  细胞转染24 h制作单细胞悬液，将细胞接种于96孔板，设3个复孔，37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，培养24、48、72、96 h，加入 CCK-8试剂继续培养1.5 h，取450 nm波长处检测每孔的吸光值（A），相对增殖率（%）=各组A/NC组A×100%计算。

1.6检测细胞凋亡水平  各组细胞转染48 h制作单细胞悬液，将细胞移入离心管，离心5 min，弃上清，PBS溶液洗涤，收集提取重悬细胞，加入5 μl Annexin V-FITC 4 ℃孵育15 min，加入5 μl PI混匀孵育15 min，经流式细胞仪检测分析细胞凋亡率。

1.7检测CDCA5在裸鼠肿瘤中的表达  将HepG2细胞接种于培养皿中，用慢病毒pSICOR、pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro感染，收集HepG2正常细胞组，CDCA5低表达组，CDCA5高表达组对数期细胞，调整细胞悬液浓度，用0.25%的胰酶消化转移至流式细胞管并计数，用无血清培养基调整细胞浓度1×107个/ml。每只小鼠皮下注射0.2 ml，自接种之日起每天观察裸鼠状态，成瘤时间及瘤体生长情况。第30天处死裸鼠，取出肿瘤，称重并计算每组肿瘤的平均瘤重。

1.8统计学方法  采用SPSS软件IBM version 22.0进行处理，计量资料的表示采用（x±s）表示，多组计量数据间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t 检验，非正态分布采用Mann-Whitney U检验，Kaplan-Meier法计算患者的累积无瘤生存率（RFS）及总生存率（OS）。采用Log-rank法进行单因素分析，比较生存时间的差异。采用双侧检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

2结果

2.1 CDCA5在肝癌细胞株的表达  HepG2肝癌细胞株CDCA5蛋白表达量最高，SMMC-7721细胞株CDCA5蛋白表达量最低，构建敲低及高表达CDCA5的质粒，Western blot检测敲低及过表达CDCA5后的变化。对照组、阴性对照组、CDCA5低表达组、CDCA5高表达组蛋白相对表达量分别为（0.59±0.14）、（0.56±0.16）、（0.06±0.02）、（0.77±0.11），组间比较差异有统计学意义（P<0.05）;另外，低表达组的表达量最低，抑制效率最高，与各组比较，差异均有统计学意义（P<0.05），见图1。

2.2肝癌细胞增殖  检测低表达和高表达细胞生长增殖情况，生长情况以NC组作对照，转染 24 h后与空白组相对增殖率比较，差异均无统计学意义（P>0.05），转染48、72 h后，低表达组HepG2细胞抑制率分别为（65.97±0.58）%、（70.10±1.04）%。随着转染时间延长肝癌细胞增殖率受抑制;高表达组HepG2细胞存活率分别为（128.93±0.95）%、（130.03±0.35）%。随着转染时间延长，肝癌细胞存活率逐渐增强，组间比较，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3细胞凋亡情况  低表达组转染48 h的早期和晚期凋亡率分别为（19.43±2.31）%、（24.37±2.21）%均高于对照组的（4.30±0.73）%、（6.13±1.58）%及阴性对照组的（4.43±0.36）%、（6.67±2.91）%，差异均有统计学意义（P<0.05）。阴性对照组与对照组早期和晚期凋亡率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

2.4成瘤动物实验检测  裸鼠皮下分别注射普通HepG2细胞及CDCA5低表达HepG2细胞，对照组第6天出现肿瘤，CDCA5低表达组第7天出现肿瘤。瘤体逐渐增大，直至第30天对照组瘤体重量分别为（0.93±0.06）g，CDCA5低表达组（0.69±0.10）g，随着时间推移对症组瘤体重量高于CDCA5低表达组，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.5免疫组化检测CDCA5  对照组、低表达组织中CDCA5蛋白的阳性表达率分别为 86.5%、31.8%，在低表达组裸鼠肿瘤组织中CDCA5阳性率限制降低，见图2。

3讨论

原癌基因激活、抑癌基因失活、相關基因表达异常、细胞增殖和凋亡能力失常、生长因子和受体异常表达等导致肝细胞癌的发生发展[5，6]。临床研究显示细胞增殖及凋亡失控是肿瘤发生发展的一个重要机制[7]。细胞周期蛋白表达异常尤为突出，因此调节和抑制细胞周期蛋白酶，可介导肿瘤细胞发生发展，延缓或终止肿瘤组织形成。本研究发现，CDCA5在HCC癌及裸鼠成瘤组织中表达量升高，提示可以通过调控CDCA5干预肝癌的形成。相关研究提示CDCA5可能在肝癌的发生和发展过程中发挥了重要作用。对于CDCA5功能的研究比较缺乏。本研究结果显示随着转染时间延长，肝癌细胞存活率增强，通过CDCA5低表达观察在肝癌HepG2细胞和裸鼠成瘤中发生发展的功能进一步探讨。

既往部分研究提示CDCA5可预测癌症患者的预后。在尿路上皮细胞癌、口腔鳞癌、非小细胞肺癌中的研究发现，CDCA5高表达与总生存率、局部或是全身复发、预后具有密切联系，可认为是其危险因素[8，9]。本研究中低表达组转染48h的早期和晚期凋亡率分别为（19.43±2.31）%、（24.37±2.21）%，均高于对照组。此外我们，发现CDCA5 阳性表达率越高，肿瘤分化程度越差，这表示CDCA5具有加速肝癌细胞分裂，参与肝癌发生发展机制 ，从而导致肿瘤恶性程度增高，在裸鼠成瘤动物实验得到进一步证实。

肝癌分期把肿瘤直径作为一个独立危险因素，评估患者预后。本研究通过裸鼠皮下注射普通HepG2细胞及CDCA5低表达HepG2细胞，两者具有统计学差异。敲低CDCA5裸鼠肿瘤组织直径较小，生长周期延长，说明调控CDCA5的表达对肿瘤的预后具有一定的作用。但只以肿瘤直径判断预后具有局限性，需结合肿瘤生物学特性，从而让肿瘤直径指标对患者预后更有价值。

总之，本实验通过调控CDCA5 表达水平，有效抑制肝癌细胞的增殖并促进其凋亡。从而对肝癌基因靶向治疗初步提供了一个新的方向，CDCA5的异常增高有望成为肝细胞癌早期诊断和病情判断的一项参考指标，就CDCA5在肝癌中的特异性及信号通路可作为突破口。

参考文献：

[1]朱继业，李照.中晚期肝癌的转化手术切除[J].腹部外科，2020，2（4）：105-108.

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[5]Erlinda G，Joshua R，Seiya L，et al.Cell cycle checkpoint control：The cyclin G1/Mdm2/p53 axis emerges as a strategic target for broadspectrum cancer gene therapy-A review of molecular mechanisms for oncologists[J].Molecular and Clinical Oncology，2018，9（2）：115-134.

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[7]Otto T，Sicinski P.Cell cycle proteins as promising targets in cancer therapy[J].Nature Reviews Cancer，2017，17（2）：93-115.

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收稿日期：2020-05-25;修回日期：2020-06-16

编辑/钱洪飞

基金项目：四川省医学科学院·四川省人民医院2017年院科研基金资助项目（编号：2017LY19）

作者简介：李德新（1983.11-），男，四川成都人，硕士，主治医师，主要从事肝胆胰腺疾病的基础与临床研究

通讯作者：李华（1985.7-），女，四川广安人，硕士，主治医师，主要从事腹部及心脏超声诊断工作