徐雪雪， 王春玲， 马明阳， 陈思锦， 田万年*

(1. 吉林农业科技学院动物科技学院，吉林 吉林 132101； 2. 吉林省永吉县黄榆乡畜牧兽医站，吉林 永吉 132223)

羊泰勒虫病是由泰勒属(Theileria)的多种原虫引起羊的血液原虫病[1]。该病可通过蜱传播，羊被携带虫体的蜱叮咬后，虫体由血液侵入羊体内并寄生在巨噬细胞、淋巴细胞、红细胞中进而引发病理现象。我国已报道能够感染羊的泰勒虫分别为吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫，其中吕氏泰勒虫作为国内的优势虫种分布范围广且危害最大[2]。本病危害严重，外地引进羊发病率较高，慢性发病羊生长发育变缓，产肉量和产毛量显著下降，给养羊业造成重大经济损失[3]。为了解吉林市左家镇羊泰勒虫优势虫种及感染情况，本试验应用血液涂片镜检结合PCR方法对采自吉林市左家镇4个村的绵羊血液样品进行羊泰勒虫检测，为相关防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 血液样品无菌采集左家镇马虎头村、大官地村、黄花村、河湾子村饲养的绵羊抗凝血样品278份，用于相关项目检测。

1.2 主要试剂及仪器血液DNA提取试剂盒(上海生工生物工程有限公司)、DNA 2 000 Marker[宝生物工程(大连)有限公司]、琼脂糖(上海生工生物工程有限公司)、PCR仪(百泰克生物技术有限公司)。

1.3 血液涂片染色镜检制作血涂片，滴加甲醇固定，放入装有吉姆萨染液的染缸中，室温染色6 h，然后取出血涂片用蒸馏水冲洗，自然晾干后显微镜检查羊泰勒虫体。

1.4 分子生物学检测

1.4.1 基因组DNA提取将采集的绵羊抗凝血按照血液基因组DNA提取试剂盒说明书程序提取全血基因组DNA，-20 ℃保存备用。

1.4.2 羊泰勒虫PCR检测及测序根据GenBank 收录的羊泰勒虫18S rRNA基因序列，分别设计3种羊泰勒虫PCR扩增引物(见表1)。PCR反应体系25 μL ：TaqPreMix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA 2 μL，dd H2O 9.5 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性45 s，55～62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物送至上海生工生物技术有限公司进行核苷酸序列测定。

表1 羊泰勒虫PCR扩增引物

2 结果

2.1 血涂片染色镜检羊血涂片经吉姆萨染色后在显微镜下观察，发现梨形虫体(见图1)。

图1 羊血涂片染色镜检结果(1 000×)

2.2 羊泰勒虫PCR检测及测序通过对278份绵羊血液样品进行PCR扩增，检测到吕氏泰勒虫特异性条带(见图2)。回收10份PCR扩增产物经核苷酸序列测定，结果与GenBank 登录的吕氏泰勒虫(登录号：AY262119)同源性为99.9%，与尤氏泰勒虫(登录号：AY262116)同源性为96.4%，与绵羊泰勒虫(登录号：FJ603460)同源性为96.0%，鉴定左家镇流行的羊泰勒虫均为吕氏泰勒虫(T.luwenshuni)。

M：DL 2 000 DNA Marker； 1～5：检测样品； 6：阴性对照图2 羊泰勒虫PCR扩增结果

2.3 不同村羊泰勒虫感染率对4个村羊泰勒虫PCR检测结果进行统计，结果见表2。各村羊泰勒虫平均感染率为19.06%。其中马虎头村羊泰勒虫感染率最高，为32.89%；大官地村感染率最低，为8.33%。

表2 左家镇4个村羊泰勒虫感染情况

3 结论

经检测鉴定，吉林市左家镇羊泰勒虫感染虫种为吕氏泰勒虫，平均感染率为19.06%，应加强羊泰勒虫病的防治工作。

4 讨论

近年来我国养羊业发展迅速，羊泰勒虫病在大部分省(区、市)均有流行，造成很大的经济损失[4]。通常情况下羊感染一定数量的泰勒虫才会表现出临床症状，多为隐性感染。该病主要造成免疫器官受损，引发免疫抑制，免疫功能下降，严重影响生产性能。对羊泰勒虫虫种的收集与鉴定是防治该病的基础。本试验应用血液涂片检查和PCR方法对左家镇羊泰勒虫进行检测，结果显示4个村均有吕氏泰勒虫感染。分析原因可能与当地生态环境有关，左家镇为低山丘陵地区，森林茂密，利于传播媒介蜱的生长繁殖，放牧时羊易受到蜱叮咬，从而感染羊泰勒虫。本次调查发现所感染虫种仅为吕氏泰勒虫，尚未检测到尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫，可为吉林市左家镇羊泰勒虫病的防控提供参考依据，同时也丰富了我国羊泰勒虫流行病学资料[5～7]。