徐 雨， 冯明祥， 韦登雄， 图 雅， 刘 苹， 杨和俊， 陈永翠

(贵州省关岭布依族苗族自治县动物疫病预防控制中心，贵州 关岭 561300)

寄生虫病是牛的三大疾病之一，常见的牛寄生虫有线虫、吸虫、绦虫、球虫和血液原虫等。动物感染寄生虫后多呈慢性消耗性经过，临床表现为消瘦、水肿、贫血、便秘下痢交替发生，最后因恶病质而死亡，造成很大的经济损失[1～3]。2020年4月，关岭布依族苗族自治县某联保户养殖关岭牛3头，出现不明原因消瘦，被毛凌乱，排茶色尿，疑似寄生虫感染。为查明原因，对牛进行采样检测，根据检测结果进行针对性治疗。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 检测病料采集3头牛的粪便、血液(颈静脉采集全血，-20 ℃冻存)各1份。

1.1.2 主要试剂与仪器尼龙兜(60目和120目)、玻片、染色缸、生物显微镜、无菌采血管；吉姆萨染色试剂(Solarbio)、2×TaqMaster Mix试剂(康为世纪生物科技有限公司)、琼脂糖粉(Amresco)、D 5000 DNA Ladder(Biomiga)、GoldView核酸染料(Solarbio)、天根DP318-02血液基因组DNA提取试剂盒(北京诺博莱德科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 虫卵检查按照尼龙兜集卵法[4，5]收集虫卵后，显微镜检查虫卵形态、大小，鉴定虫卵种类。

1.2.2 血液原虫检查制作血液推片，自然干燥后甲醇固定5 min，10%吉姆萨染色，24 h后清水冲洗，晾干镜检[6]。

1.2.3 血液原虫PCR鉴定按照GenBank发表的相关血液原虫序列设计引物，双芽巴贝斯虫引物参照相关文献[6，7](见表1)。

表1 引物序列

将采集的3份血液分别标记为1～3号，用血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA，进行PCR扩增。附红细胞体和双芽巴贝斯虫检测选用同一反应体系。反应体系10 μL：2×TaqMaster Mix 5 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各0.2 μL，DNA模板0.2 μL，ddH2O 4.4 μL。扩增条件：94 ℃ 预变性5 min，94 ℃ 变 性 30 s，60 ℃ 退 火30 s，72 ℃ 延 伸60 s，共 35个循环；……