蒋壮飞，何家垣，马蓉蓉，李清瑶，杨莉莉，谭玲，张起辉

（1 重庆大学化学化工学院，重庆400044； 2 重庆大学药学院，重庆400044）

引 言

在芸香科柑橘属植物中，柠檬是常见的一种，其化学成分主要包括维生素类、黄酮类和生物碱类化合物。柠檬整株植物以根与果最有药用价值，故常以这两个部分入药，具有化痰止咳，缓解支气管炎和抗炎抗氧化等作用。在医疗过程中，柠檬还可以用于预防和治疗高血压、心脏病等[1−3]。中国柑橘类水果年产量仅次于巴西，大多数柑橘被直接作为鲜果食用，但由于销售总量有限，许多新鲜水果腐烂变质，经济损失巨大。为了解决这些问题，柑橘类水果主要往榨汁的方向发展，但是榨汁所引起的“后苦味”影响了果汁的口感。水果自身不苦，“后苦味”是指在榨汁和储存期间，水果生成了具有苦味的物质，使果汁带有苦味。研究表明，柠檬汁的苦味主要是由其中的吴茱萸内酯引起的。其原理是：在酸性条件下，当柠檬果肉组织处于冰冻状态或受到机械碰撞时，在内酯环水解酶的存在下，苦味物质前体被水解，转化为苦味物质吴茱萸内酯（C26H30O8，分子量：470.53，白色、味苦，结晶状，易溶于酯性有机溶剂，难溶于水，在甲醇、乙醇中溶解度较大），使果汁变苦[4−7]。

目前，柠檬汁苦味的去除包括物理、化学和生物方法，如吸附技术[8]、膜分离技术[9−10]、包埋法[11]、酶法脱苦[12]、微生物脱苦、pH 调节、超临界流体CO2萃取和酶解等[8,13−16]。其中，吸附技术因其经济效益高而得到最广泛的应用。吸附剂的性质好坏是影响吸附效果强弱的重要因素之一。目前市场上常用的吸附剂有树脂和键合硅胶等。这些吸附剂面临着耗时、不完全去除苦味物质和非特异性等问题。因此，开发一种高效、快速、特异性的吸附剂是去除柠檬汁中吴茱萸内酯的迫切需要。

近年来，分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）由于其高特异性而得到了广泛的关注。在含有模板分子的溶液中，加入功能单体和交联剂，在特定的条件下聚合，并用适当的洗脱剂去除模板分子以获得MIPs。然而，本体分子印迹聚合物的应用受到识别位点数量有限以及大多数印迹位点嵌入高刚性聚合物基质中这一事实的限制。表面分子印迹聚合物（surface molecularly imprinted polymers，SMIPs）的出现解决了传统分子印迹聚合物分离效率低和分离费时的问题[17]。SMIPs 是指在支撑材料表面上的分子印迹层聚合形成了核壳结构的聚合物，提高了印迹效率并加快传质速度[18]。本研究选择稳定性良好，生物兼容性稳定，易于制备和功能化的SiO2纳米颗粒作为支持材料[19−26]。

本文采用表面印迹法合成吴茱萸内酯的分子印迹聚合材料，优化反应条件，并通过透射电子显微镜（TEM）和傅里叶红外（FT−IR）对所得分子印迹聚合物材料进行表征。最后，通过高效液相色谱（HPLC）测定柠檬汁中吴茱萸内酯在吸附前后的含量，结果表明SMIPs 能够很好地吸收柠檬汁中的吴茱萸内酯。

1 实验部分

1.1 实验药材

从四川安岳购买的新鲜柠檬，在4℃条件下榨汁并保存。

1.2 二氧化硅粒子的合成及修饰

用斯托伯法（Stöber）合成均相SiO2颗粒[27]，室温下在平底烧瓶中加入49 ml 乙醇，4 ml 水和3.2 ml 氨水。在上述混合溶液中加入51 ml 乙醇和6 ml 原硅酸乙酯，继续搅拌24 h，高速离心后得到白色沉淀，用乙醇和水分别洗涤3 次，于真空条件下干燥12 h，得到白色SiO2颗粒。

通过对二氧化硅颗粒进行两步改性制备了丙烯酰胺（APTES）改性的二氧化硅。首先，将APTES接枝到SiO2的表面。 将0.4 g SiO2颗粒超声分散在100 ml新蒸无水甲苯中。加入8 ml APTES，在N2环境下回流12 h，得到APTES修饰的SiO2颗粒，随后用无水甲苯洗涤，然后再次分散在无水甲苯中。将8 ml 丙烯酰氯和100 ml 无水甲苯与APTES 改性的SiO2悬浮液混合，并加入适量的无水碳酸钾作为催化剂。在室温下，于N2环境中磁力搅拌12 h，然后在10000 r/min 的条件下离心10 min。其次，依次用甲苯、水和乙醇洗涤所得产物3次，并在50℃下真空干燥12 h，以获得表面具有双键的改性SiO2颗粒。

1.3 制备分子印迹材料

将100 μl 甲基丙烯酸MAA（功能单体），235 mg吴茱萸内酯（模板）溶于100 ml 乙腈中，预聚合6 h。加入100 mg 改性SiO2、1688 mg 乙二醇二甲基丙烯酸酯EGDMA（交联剂），10 mg 偶氮二异丁腈AIBN（引发剂）和40 mg 无水碳酸钾（催化剂）后，N2脱氧10 min，在冰水浴中浸泡10 min，然后在磁力搅拌下于60℃反应6 h 和70℃反应24 h。离心得到的聚合物材料，依次用乙醇和水洗涤3 次并于50℃真空干燥。在甲醇∶冰醋酸（9∶1）混合洗涤溶液中，用索氏提取回流洗脱吴茱萸内酯24 h。最后，将含有吴茱萸内酯孔穴的SMIPs 用水清洗，并在真空干燥箱中于45℃干燥24 h。

非分子印迹聚合物（NIPs）即在不存在模板分子吴茱萸内酯的情况下，用上述同样方法制备。

1.4 吸附实验

植物中吴茱萸内酯的含量约为40 μg/ml，因此选择该浓度作为动态吸附溶剂的浓度。将10 mg SMIPs 或NIPs加入到6 ml 40 μg/ml的标准吴茱萸内酯溶液中。混合物在气浴恒温振荡器中以105 r/min，35℃分别吸附10、20、40、60、80、100、120、180、240 min，每组平行实验3 次。每组样品取上清液进行HPLC分析。吸附量（Q）用式(1)计算：

其中，Q代表吸附量;Ci(μg/ml)和Ce(μg/ml)分别代表吴茱萸内酯吸附前后的浓度;V 代表萃取的体积;m代表SMIPs或NIPs的质量。

静态吸附实验的操作与上述实验相似。在6 ml吴茱萸内酯溶液中添加10 mg SMIPs 或NIPs，其中，吴茱萸内酯的浓度范围是5～500 g/ml。混合物仍然以105 r/min 和35℃在振荡器上吸附60 min，每组实验平行进行3次。通过HPLC分析各组的上清液，并根据式(1)计算吸附量。

1.5 选择性实验

以诺米林和黄柏酮为竞争性干扰物质，研究了分子印迹聚合物对吴茱萸内酯的选择性和特异性吸附能力。将15 mg SMIPs或NIPs加入含有300 μg/ml 吴茱萸内酯、诺米林和黄柏酮的混合溶液中，在振荡器上吸附60 min，取上清液，用HPLC 检测吴茱萸内酯、诺米林和黄柏酮吸附前后的浓度，根据式（1）计算出SMIPs 和NIPs 对各个物质的吸附量，每组平行实验3次。

1.6 印迹聚合物的应用

将柠檬榨汁，于4℃保存过夜，随后15000 r/min离心15 min，加入适量甲醇以沉淀柠檬汁中的蛋白质。然后，将50 mg SMIPs 加入5 ml 上述制备柠檬汁中，在振荡器上吸附60 min。吸附完全后，通过离心收集SMIPs，用2 ml 甲醇超声洗脱吸附的吴茱萸内酯。洗脱液挥干，用3 ml 甲醇复溶，HPLC 检测吴茱萸内酯的浓度[28]，每组平行实验3次。

1.7 高效液相分析

HPLC分析条件：采用Agilent 1260系统，色谱柱为TC−C18柱子（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速0.6 ml/min，柱温30℃。以55%的乙腈和45%的0.1%磷酸水溶液作为流动相。进样量10 μl，检测波长210 nm。

2 实验结果与讨论

2.1 分子印迹聚合物的制备

分子印迹聚合物合成过程如图1 所示。首先，对SiO2进行化学修饰，得到含有双键的SiO2纳米粒子；然后，在SiO2表面聚合上分子印迹层；最后，洗脱模板，得到具有印迹空穴的SMIPs。

图1 表面分子印迹材料的合成示意图及其脱苦步骤Fig.1 Schematic representation of the preparation of surface molecularly imprinted materials and the process of debitterization

为了提高SMIPs的吸附效率，本文考察了模板、功能单体和交联剂之间的比例，每组平行实验3次。在预聚合过程中，MAA 的羧基与吴茱萸内酯通过氢键结合。在预聚合过程中，功能单体越多，越容易和模板分子之间形成氢键，然而，过量的功能单体会使非特异结合位点的数量增加，并且自身会结合，使得有效的结合位点数量下降。本文考察了不同模板与功能单体的比例（1∶1～1∶5）,如图2（a）所示，在吴茱萸内酯与MAA 摩尔比为1∶2 时，合成的SMIPs 具有最大的吸附量。类似地，功能单体和交联剂的比例影响SMIPs 吸附效果。交联剂过少会导致交联度不够，识别能力降低，而过度交联则会导致聚合物过于刚性，难以达到吸附平衡，且模板移除不彻底。本文考察了功能单体和交联剂1∶4～1∶7 的摩尔比，结果如图2（b）所示，最好的摩尔比为1∶6。

图2 合成条件的优化Fig.2 Optimization of synthesis conditions

2.2 SMIPs表征

改性SiO2、SMIPs 的红外光谱和透射电子显微镜结果如图3 所示。根据TEM 图像显示[图3(b)、(c)]，改性SiO2表面光滑，直径约50 nm，相比之下，SMIPs 表面粗糙，且直径更大，这说明分子印迹聚合层成功聚合到二氧化硅表面。透射电镜结果表明SMIPs 具有清晰的核−壳结构，证明SMIPs 成功合成。

SiO2、改性SiO2、SMIPs 和NIPs 的红外谱图如图3（a）所示。SiO2在1106 cm−1处有明显的不对称Si—O—Si 伸缩振动，在800 cm−1处有对称Si—O—Si伸缩振动，在944 cm−1处有Si—OH 振动。改性的二氧化硅粒子在1740 cm−1、1446 cm−1峰分别对应于酯键的C O 和氨基基团。这说明丙烯酰氯和APTES成功修饰到二氧化硅表面。SMIPs和NIPs红外谱图中位于2945 cm−1和1263 cm−1的峰分别对应于来自EGDMA 的—CH3和C—O—C，且MIPs 和NIPs 的红外谱图类似。综上，红外谱图也证明了表面分子印迹材料的成功合成。

图3 表面分子印迹材料的表征Fig.3 Characterization of surface molecularly imprinted materials

2.3 SMIPs吸附实验

图4 材料的吸附性能Fig.4 Adsorption capacity of materials

2.3.1 动态吸附 SMIPs和NIPs的动态吸附曲线如图4（a）所示。SMIPs对吴茱萸内酯的吸附量随着吸附时间的增加而逐渐增加，直至60 min 达到平衡，最大的吸附量为5.76 mg/g。相比于SMIPs，NIPs 在40 μg/ml 吴茱萸内酯浓度下，其吸附量基本保持不变，且吸附量很低。这表明在低浓度条件下，NIPs由于其表面没有特异性识别位点存在，对吴茱萸内酯基本没有吸附作用。采用一级动力学模型和二级动力学模型来分析动态吸附过程：

式中，K1(min−1)和K2(g/(mg·min))分别代表一级动力学常数和二级动力学常数；t 代表吸附时间；Qt和Qe分别代表在时间t 时的最大吸附量和平衡时的吸附量。相关参数如表1 所示。结果表明，实验数据更符合二级动力学，说明吸附过程由化学吸附所控制，Qe−MIP和Qe−NIP分别为6.667 mg/g 和0.233 mg/g。2.3.2 静态吸附 图4（b）表示的是SMIPs/NIPs 静态吸附曲线。随着吴茱萸内酯溶液浓度的增加，SMIPs 吸附量快速上升，并在400 μg/ml 浓度时达到饱和吸附。饱和时SMIPs的吸附量为27.72 mg/g，吸附 量 是NIPs 的3.4 倍。Langmuir 和Freundlich 方 程用于描述本文静态吸附实验，方程如下所示[29]:

表1 一级和二级动力学模型拟合参数Table 1 Relevant parameters of pseudo-first-order and pseudo-second-order model

式 中，KL代 表Langmuir 常 数；KF和n 表 示Freundlich 常数；Qm和Qe分别代表最大吸附量和在Ce浓度时的平衡吸附量；Ce表示吴茱萸内酯的浓度。两种模型相关参数计算如表2 所示，Langmuir 模型（R2=0.958）比Freundlich模型（R2=0.919）更符合实验数据。一般地，Langmuir 模型被认为是单层吸附理论，而Freundlich 模型则被认为是单层吸附和多层吸附相结合。根据Langmuir 模型相关参数所得，理论上SMIPs 和NIPs 的最大吸附量为29.412 mg/g 和

12.345 mg/g。

表2 Langmuir和Freundlich 方程拟合参数Table 2 Relevant parameters of Langmuir and Freundlich equation

2.4 选择性实验

诺米林和黄柏酮结构与吴茱萸内酯类似，被选为竞争性干扰物质。选择性实验结果如图4（c）所示，SMIPs 对吴茱萸内酯的吸附量为20.88 mg/g，而对诺米林和黄柏酮的吸附量仅1.87 mg/g 和4.31 mg/g。SMIPs 对吴茱萸内酯的吸附量分别是诺米林和黄柏酮的11.16倍和4.84倍，这表明SMIPs材料内部存在吴茱萸内酯模板分子印迹空穴。为了更好地说明SMIPs 的特异性，印迹因子（α）和选择性因子（β）用于评价SMIPs的选择性和专一性。α 和β的计算公式如下：

式中，QMIP和QNIP分别表示SMIPs 和NIPs 的吸附能力;αtem和αana分别表示模板分子和类似物的印迹因子。吴茱萸内酯、诺米林和黄柏酮的印迹因子分别是4.33、1.57 和2.37。吴茱萸内酯相对于诺米林和黄柏酮的选择性因子是2.75和1.83。上述结果表明SMIPs对吴茱萸内酯有更好的选择性。

2.5 SMIPs的应用

柠檬汁脱苦前后的色谱图如图5所示。在加入SMIPs 前，柠檬汁色谱图中有吴茱萸内酯的峰，加入SMIPs 进行脱苦处理后，可明显看出吴茱萸内酯的峰消失了。而洗脱液色谱图中出现吴茱萸内酯的峰，这说明柠檬汁中的吴茱萸内酯已经被吸附到了SMIPs 上。此外，其他柑橘属果汁，如橘汁、柚子汁等也含有大量的吴茱萸内酯，推测SMIPs 能够应用于柑橘类果汁的脱苦处理中。简言之，SMIPs 可作为一种优良的吸附剂，用于柑橘类果汁的脱苦处理。

图5 表面分子印迹材料对柠檬汁的脱苦过程的液相色谱图Fig.5 Liquid chromatogram of demitoring process of lemon juice by surface molecularly imprinted materials

3 结 论

本研究以SMIPs为吸附剂从柠檬汁中去除吴茱萸内酯，从而达到对柠檬汁的脱苦效果，TEM 和FT−IR 均可表明分子印迹聚合物的合成。此外，由于SiO2颗粒具有化学稳定性和生物相容性，且SMIPs具有核壳−结构，吸附动力学快，结合力强，基于二氧化硅颗粒的SMIPs可以应用于工业生产中果汁的脱苦过程。不同于传统的脱苦方法，该方法操作简单、省时、脱苦效率高，1 h 内即可达到饱和吸附，且吸附量可达27.72 mg/g。在果汁中加入SMIPs后，柠檬汁中的吴茱萸内酯几乎全部被提取出来。本研究为工业生产中果汁的脱苦提供了一个方向。