李 昕， 戴凌燕， 刘 红，3， 邓景致， 李志江，3，*， 张东杰，3， 王成涛

(1.黑龙江八一农垦大学 食品学院， 黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学 生命科学技术学院， 黑龙江 大庆 163319；3.北大荒现代农业产业技术省级培育协同创新中心， 黑龙江 大庆 163319；4.北京工商大学 北京市食品添加剂工程技术研究中心， 北京 100048)

鲁氏酵母菌(Zygosaccharomycesrouxii)是一种常见的耐高渗透压酵母菌，可以在高糖或者高盐的环境中生长[1]。作为传统的发酵菌种之一，鲁氏酵母菌在发酵过程中代谢生成乙醇、芳香杂醇以及类似于焦糖味的呋喃酮类化合物而增强食品的风味，是酱油和豆酱食品发酵过程中的重要微生物[2]。鲁氏酵母菌在发酵过程中很容易受到环境因素影响，如盐、糖以及酸胁迫等，鲁氏酵母菌通过表达胞内抗氧化酶系活性抵御盐胁迫带来的影响[3]。Liu等[4]研究表明，当鲁氏酵母菌受到糖胁迫时，细胞会通过调节自身微环境来缓解糖胁迫带来的伤害。

国内学者对鲁氏酵母菌的研究大多集中在发酵食品中的应用，如鲁氏酵母菌对豆酱或酱油风味的提升，以及对面包品质和香肠加工工艺的影响[5-6]，但对其在盐、糖等环境中的生长特性及增香机制尚未完全揭示；国外学者研究的重点则集中于鲁氏酵母菌的耐盐机制，以及在高渗环境下鲁氏酵母菌的生长特性[7]，而在高糖环境下鲁氏酵母菌生长、代谢及相关基因表达方面研究较少。本实验室在前期研究中发现，在D-果糖调控下，鲁氏酵母菌发酵液呈现更好的风味，推测糖调控促进鲁氏酵母菌代谢合成更多的风味物质；因此，结合转录组分析，本研究进一步探索D-果糖对鲁氏酵母菌生理特性的影响，揭示其增香的分子机制，以期为鲁氏酵母的发酵产香提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲁氏酵母菌，购自中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为No.32899。NaCl，化学纯，购自天津大茂化学试剂公司；D-果糖，化学纯，购自上海源叶生物技术公司；YPD培养基，购自青岛希望生物技术有限公司；其他试剂均购买于德国CNW科技有限公司。

1.2 仪器与设备

HZQ- QX型全温空气恒温振荡器，北京东联哈尔仪器制造有限公司；Centrifuge5430R型高速冷冻离心机，德国艾尔德股份公司；SW- CJ- 2G型超净工作台，苏州净化设备有限公司；FE28- S型pH计，瑞士梅特勒- 托利多公司；1290 UHPLC型超高效液相色谱仪，美国Agilent公司；Triple TOF 6600型(配有Analyst TF 1.7软件)高分辨质谱仪，美国AB Sciex公司。

1.3 实验方法

1.3.1鲁氏酵母菌的培养

在250 mL三角瓶中装入100 mL YPD液体培养基，接入5 mL的已活化好的菌液，在全温振荡器中28 ℃、180 r/min条件下培养27 h。将培养后的菌液分别取出5 mL，放在100 mL YPD(含5 g YPD, 18 g NaCl)液体培养基中，命名为YPD对照组；放在100 mL YPD+Fru(含5 g YPD, 18 g NaCl, 12 g D-果糖)液体培养基中，命名为YPD+Fru实验组[8]。每个处理组进行3次生理重复实验，分别培养0、3、5、7 d。

1.3.2D-果糖对鲁氏酵母菌生理特性影响指标的测定

取10 mL菌液于4 800 r/min离心15 min，弃去上清液，再加蒸馏水至10 mL，再次离心15 min。重复操作3次。将离心后的菌体用YPD培养基定容至10 mL，摇匀后，用1 cm比色皿测定在600 nm下的OD值。取5 mL发酵液样品，用pH计测定pH值。采用血球计数法测定鲁氏酵母菌数量[8]。

1.3.3鲁氏酵母菌发酵液代谢物含量的测定

取100 μL样本，加入400 μL含有2-氯苯丙氨酸的提取液(甲醇、乙腈体积比为1∶1，2-氯苯丙氨酸质量浓度为2 μg/mL)，涡旋混匀30 s，超声5 min(冰水浴)，零下20 ℃静置1 h。将样本于4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取425 μL上清液于EP管中，在真空浓缩器中干燥提取物。向干燥后的代谢物中加入100 μL 水复溶，涡旋30 s，冰水浴超声10 min。将样本于4 ℃，12 000 r/min离心15 min，取出60 μL上清液于2 mL进样瓶，每个样本各取10 μL混合成QC(quality control)样本，再取60 μL上机检测[9]。

1.3.4鲁氏酵母菌转录组学测定与分析

1.3.4.1 RNA提取

将培养好的鲁氏酵母菌悬液于4 ℃条件下，12 000 r/min离心3 min，弃上清液后置于离心管(千分之一浓度的DEPC水处理)，放入液氮中，待菌体凝固后倒入预冷好的研钵中进行研磨。将菌体研磨为白色粉末，并转移到1.5 mL Eppendorf管中。采用Trizol法进行RNA提取，并对总RNA的质量初步鉴定，包括琼脂糖凝胶电泳分析RNA降解程度，以及是否有污染和Nanodrop检测RNA的纯度(以OD260/OD280表示)[10]。

1.3.4.2 鲁氏酵母菌转录组文库的构建

将提取的RNA用带有Oligo(dT)的磁珠，通过A- T互补配对与mRNA的ployA尾结合的方式，富集真核生物mRNA。加入fragmentation buffer，将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成一链cDNA；加入缓冲液dNTPs和DNA polymerase I。合成二链cDNA，随后利用AMPure XP beads纯化双链cDNA。纯化的双链cDNA再进行末端修复，加A尾并连接测序接头，用AMPure XP beads进行片段大小选择，最后进行PCR富集得到最终的cDNA文库。测序的平台为上海中科新生命生物科技有限公司，并由该公司提供技术服务。

1.3.4.3 转录组数据分析

将过滤后得到的Clean reads通过HISAT软件进行基因组定位分析，使用HTSeq软件对样品进行基因表达水平分析，模型为union[11]。结果文件分别统计了不同表达水平下基因的数量以及单个基因的表达水平。一般情况下，将FPKM(fragments per kilobase million)数值为0.1或者1作为判断基因是否表达的阈值。根据需求，利用DEGseq(differentially expressed genes)方法对基因差异表达的水平进行DEGs检测。将差异倍数Fold Change≥2，并且Q-value≤0.001的基因定义为显著性差异表达基因。GO(gene ontology)富集分析采用的软件方法为GOseq[12]。Pathway显著性富集分析以KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库中Pathway为单位，应用超几何检验，找出与整个基因组背景相比，在差异表达基因中显著性富集的Pathway。FDR(false discovery rate)≤0.05时，表示差异基因在该Pathway中显著富集，并利用KOBAS 2.0软件进行Pathway富集分析。计算方法如式(1)。

(1)

式(1)中：P，表示概率；N，所有基因中具有Pathway注释的基因数目；n，N中差异表达基因的数目；M，所有基因中注释为某特定Pathway的基因数目；m，注释为某特定Pathway的差异表达基因数目。

1.4 数据处理

样品处理和数据均为3次重复的平均值。采用软件SPSS 20.0对数据进行统计学分析，以Oneway ANOVA进行显著性检验，并采用软件GrapHPad Prism 8.0对实验数据绘图。

2 结果与分析

2.1 D-果糖调控下鲁氏酵母菌生长情况

分别对比了在YPD和YPD+Fru处理组中鲁氏酵母菌的生长情况，结果如图1。鲁氏酵母菌在添加了D-果糖的培养基中，生长情况显著优于在YPD中培养的鲁氏酵母菌。随着发酵时间进行到3 d，处理组中鲁氏酵母菌的OD和细胞菌数极显著高于YPD对照组(P<0.001)，说明在YPD培养基中添加D-果糖有利于鲁氏酵母菌生长。姜威等[13]的研究也表明，以糖为碳源时，有利于酵母菌生长，代谢产物增加。研究结果表明，向YPD培养基中添加D-果糖对鲁氏酵母菌细胞的生长有促进作用。

*** 表示差异极显著(P<0.001)。图1 D-果糖调控对鲁氏酵母细胞OD值和细胞菌数的影响Fig.1 Effects of D-fructose regulation on OD value and numbers of Zygosaccharomyces rouxii

2.2 D-果糖调控下鲁氏酵母菌发酵液pH值的变化

*** 表示差异极显著(P<0.001)。图2 D-果糖调控对鲁氏酵母菌发酵液pH值的影响Fig.2 Effect of D-fructose regulation on pH value of Zygosaccharomyces rouxii fermentation broth

2.3 D-果糖调控下鲁氏酵母菌发酵液中挥发性物质变化

鲁氏酵母菌添加到豆酱中可显著提高产品的感官品质和理化品质，拓展其在发酵食品中应用[2]。在发酵后期，YPD+Fru组香味明显高于对照组，呈现典型的酱香风味。本研究对两组发酵液进行了LC- MS/MS分析，挥发性物质测定结果如表1。在酸类物质中，YPD+Fru组中丙酮酸的含量显著高于YPD组。丙酮酸在糖酵解代谢通路中起着重要作用，也是糖酵解与三羧酸循环之间的纽带，代表了D-果糖在代谢过程中的碳流走向[19]。丙酮酸具有醋酸香气和愉快的酸味，具有很好的防腐保鲜功能[20]。丙三醇能抑制底物和产物中的细菌，保护细胞抵抗胁迫[21]。甲酸乙酯有果香味，当发酵进行到第5天时，甲酸乙酯的含量显著高于对照组。呋喃酮是一种焦糖味的化合物，在菠萝、草莓[22]和芒果[23]中均有发现。在发酵进行第5天时，YPD+Fru组中呋喃酮的含量均高于YPD组，表明D-果糖有利于鲁氏酵母菌代谢合成更多的呋喃酮。碘苯酚的气味略微有刺激性，添加D-果糖后，YPD+Fru组中碘苯酚的含量低于对照组，推测D-果糖对有刺激性的气体有一定的抑制作用。在检测到的挥发物中，酸类物质占比较大，说明添加D-果糖对鲁氏酵母菌发酵产酸影响较大。

表1 D-果糖调控的鲁氏酵母菌挥发性物质分析结果Tab.1 Analysis of volatile substances of Zygosaccharomyces rouxii after D-fructose regulation

倍数变化指两种培养条件下发酵液中物质相对定量的比值。

2.4 鲁氏酵母菌差异表达基因分析结果

分析鲁氏酵母差异表达基因数目，结果如表2。培养基中添加D-果糖的鲁氏酵母菌经发酵3 d后，7 469个基因的基因水平发生显著变化(P<0.001)，其中，上调基因3 731个，下调基因3 738个；在发酵进行5 d时，4 611个基因表达水平发生显著变化(P<0.001)，其中2 216个基因表达上调，2 395个基因表达下调；发酵7 d时，对8 611个基因进行了差异比较(P<0.001)，其中4 354个基因上调，4 257个基因下调。因此，D-果糖调控可引起鲁氏酵母菌糖及其他代谢过程中基因的显著变化，分析其具体变化情况有利于明确其增香机制。

表2 差异表达基因数目Tab.2 Numbers of differentially expressed genes 个

2.5 鲁氏酵母菌GO富集分析结果

GO富集分析涵盖了3个方面，分别描述基因的分子功能(molecular functions, MF)、细胞组分(cellular components, CC)、生物过程(biological processes, BP)，因此GO功能显著性富集分析能给出差异表达基因与哪些生物学功能显著相关。本研究通过对差异表达基因进行GO富集分析，得到了发酵3、5、7 d的差异基因GO富集柱状图(图3)。在图3中，纵坐标为富集的GO term，横坐标为该term中差异基因的数量，本研究挑选了富集最显著的30个GO term。

与对照组比较，在发酵3 d时，在YPD+Fru组中，鲁氏酵母菌MF组中涉及催化还原、氧化还原酶的差异基因比较多。催化还原中有1 401个上调基因，1 249个下调基因；氧化还原酶活性有306个上调基因和233个下调基因。在CC组中，涉及膜蛋白复合物和线粒体的差异基因比较多。膜蛋白复合物有129个上调基因和107个下调基因；线粒体有83个上调基因和63个下调基因。在BP组中，涉及单个有机体代谢过程的差异表达基因最多，有718个基因上调表达和578个基因下调表达。在发酵5 d时，MF中涉及核糖体结构、结构分子活性的差异基因比较多。核糖体结构中有22个上调基因和123个下调基因，细胞分子活性包括43个上调基因和163个下调基因。CC组中涉及细胞和细胞组分的差异基因比较多，细胞有470个上调基因和623个下调基因，细胞组分有470个上调基因和623个下调基因。BP组中涉及生物合成过程的差异表达基因最多，有402个上调基因和580个下调基因。在第7天时，MF组中涉及氧化还原酶活性、二价无机阳离子跨膜转运活性的差异基因比较多，氧化还原酶活性有51个上调基因和85个下调基因，二价无机阳离子跨膜转运活性有50个上调基因和40个下调基因。CC组中涉及转录因子复合物和ATP酶复合物的差异基因比较多，转录因子复合物有45个上调基因和31个下调基因，ATP酶复合物包含32个上调基因和43个下调基因。BP组中涉及差异表达基因最多的是DNA模板，转录起始，有62个基因上调表达，54个基因下调表达。当发酵进行到3 d时，分子功能方面涉及到的基因变化是最明显的，发酵进行到5 d时，与细胞组分相关的基因变化最明显，发酵进行到7 d时，受底物浓度和鲁氏酵母自身代谢的影响，差异基因数目减少，与生物过程相关的基因变化最明显。

图3 差异基因GO富集柱状图Fig.3 GO enrichment histograms of differentially expressed genes

2.6 KEGG pathway富集分析

KEGG是系统分析基因功能和基因组信息的数据库。通过KEGG pathway富集能确定差异表达基因参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。KEGG pathway分析结果如表3显示，发酵第3天和7天时富集到两个相同的代谢通路：生物素代谢和氨酰基-tRNA的生物合成；发酵第5天时则富集到较多的代谢通路。选取了排名靠前的显著性富集通路进行分析，这些通路主要涉及的差异基因包括：次级代谢产物的生物合成、丙酮酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢以及果糖甘露糖代谢。鲁氏酵母菌代谢过程中能够合成很多的风味物质，如呋喃酮和甲酸乙酯等都属于其次级代谢产物，糖类物质与氨基酸代谢也有助于鲁氏酵母菌风味化合物的合成。

3 结 论

随着对鲁氏酵母菌耐高糖和耐盐机理研究的深入，其在改善豆酱和酱油等发酵食品风味的功能也不断被挖掘，添加糖类物质对鲁氏酵母的影响也逐渐被人们所关注。本研究结果表明，添加D-果糖会影响鲁氏酵母菌的生理特性，促进鲁氏酵母菌OD值和细胞菌数增加，产生的酸类物质增多，降低发酵体系的pH值。在发酵后期，D-果糖促进鲁氏酵母菌代谢合成较多的醇类、酯类和酮类等风味物质，为其在发酵食品中增香提供了理论依据。转录组结果表明，与对照组相比较，D-果糖调控使鲁氏酵母菌的差异基因数增加，功能差异基因、细胞组分差异基因和生物过程差异基因随着发酵时间的进行其差异基因数变化较大；同时KEGG pathway结果表明，这些差异基因涉及果糖代谢、次级代谢和氨基酸代谢等多种与鲁氏酵母代谢密切相关的途径。可结合风味物的变化与相应的基因变化验证挖掘关键基因，并可进一步构建鲁氏酵母工程菌。本研究初步探索了外源D-果糖调控鲁氏酵母菌增香的分子机制，明确了D-果糖调控后鲁氏酵母菌生理特性的变化，希望为进一步提高鲁氏酵母菌增香及其在发酵食品中的应用提供理论基础。

表3 差异基因KEGG pathway富集结果Tab.3 KEGG pathway of differentially expressed genes