徐悦 周明旭 朱纯 尹文竹 马芳 鲍熹 张金秋 卢宇

摘要：细菌脂多糖（LPS）对宿主细胞具有一定的毒性，但经修饰后的單磷酸类脂A（MPLA）却是一种无毒性的高效免疫佐剂。选择天然O抗原不完全的大肠杆菌J5疫苗株为出发菌株，利用λ-Red同源重组技术导入外源弗朗西斯菌（Francisella novicida）lpxE基因，缺失大肠杆菌lpxM基因。结果显示，J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM基因重组株的LPS鲎试剂活性较DH5α和J5原菌显著降低;对4周龄的ICR小鼠腹腔注射LPS提取物，重组菌和PBS组的小鼠体征及肝脏切片均正常。同时，腹腔注射大肠杆菌J5和DH5α的小鼠被毛凌乱、精神抑郁、肝脏细胞肿大，发生炎性浸润，有明显的毒性反应。以上结果说明，J5重组菌的LPS已经区别于原菌，是低毒性的MPLA产物。上述重组株的成功构建，能为生产廉价的兽用MPLA免疫佐剂奠定工作基础。

关键词：大肠杆菌;MPLA;Red同源重组;佐剂;疫苗;细菌脂多糖

中图分类号：S182   文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）17-0054-05

细菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）主要由类脂A、核心多糖和O-抗原3部分组成，其中类脂A是LPS的活性中心，其保守的结构可以被宿主细胞表面的Toll样受体4（toll like receptor 4，TLR4）识别并引起机体炎症反应，严重时甚至导致机体休克或者死亡，因此LPS又被成为内毒素[1]。单磷酸类脂A（monophosphoryl lipid A，MPLA）是类脂A在酶的催化作用下水解失去1-磷酸（或1-焦糖酸）后所形成的一种类脂A的衍生物，几乎失去了LPS的毒性，但是仍旧能够诱导机体产生各种免疫活性因子，激活吞噬细胞，MPLA具备一定的免疫佐剂和免疫调理的作用[2-3]。

大肠杆菌J5（O111：B4）菌株是美国Pfizer公司推出的用于奶牛乳房炎灭活菌苗的疫苗株[4]。它是1株O-抗原不完全的粗糙型（R）突变菌，其LPS只含有结构较为单一的Kdo2-类脂A和核心多糖结构。因J5株暴露的核心抗原具有良好的保守性和天然免疫原性，它作为抗革兰氏阴性菌感染的疫苗株在奶牛等家畜上被广泛应用[5-7]。考虑到J5株的LPS天然缺失O抗原且结构简单，30多年的疫苗使用情况显示其安全性可靠，因此本研究选择J5株作为出发菌。通过同源重组技术将J5株基因组乳糖操纵子lac的抑制子基因lacI置换为弗朗西斯氏菌属（Francisella）的lpxE基因，达到常量表达的效果，该基因编码的磷酸酶可以选择性地降解存在于类脂A分子C1位上的磷酸基团，使其LPS成为MPLA结构[8]。与此同时，缺失J5株的lpxM基因，使细菌类脂A的分子C3′位无法正常添加十四碳羟基脂肪酸链，从而只存在5条酰基链，进一步降低LPS对TLR4的激活效率，减少MPLA的毒性[9]。对J5株的LPS进行定向重组改造使其成为可以产低毒性MPLA的工程菌，应用于兽用佐剂的生产中。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒与试验动物

大肠杆菌J5株（O111：B4）、Red重组系统质粒pKD3和pCP20由扬州大学朱国强教授惠赠;弗朗西斯菌（F.novicida）基因组DNA由中国农业大学苏敬良教授惠赠;（20±2） g的清洁级ICR雌鼠购自扬州大学比较医学中心。

1.2 培养基和主要试剂

胰蛋白酶（tryptone）、酵母提取物（yeast extract），购自Oxoid公司;琼脂（agar），购自南京翼飞雪生物科技有限公司;β-半乳糖苷酶（ONPG）、L-阿拉伯糖、氯霉素（Cm）和氨苄青霉素（Amp），均购自生工生物工程（上海）股份有限公司;DL 2 000 DNA Marker、Ex Taq（10 U/L）、dNTP，均购自TaKaRa公司;DNA胶回收试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司;Trans2K plusⅡ DNA Marker、克隆载体pEASY-T1 Simple和感受态细胞，均购自北京全式金生物技术有限公司;显色基质鲎试剂盒，购于厦门鲎试剂厂。

1.3 低毒性LPS重组株的构建

1.3.1 引物设计 根据GenBank上发布的大肠杆菌（Escherichia coli） lacI基因和F.novicida lpxE基因序列，设计3对引物，P1、P2位于E.coli J5株中的lacI基因ORF的上下游外翼，用于扩增检测lacI基因及其缺失突变株。其后在P1、P2内侧设计1对同源重组引物P3、P6，其5′端序列与lacI两翼序列同源，P2的3′端序列与lpxE基因序列同源，P6的3′端序列与cat基因序列同源。依照重叠延伸PCR（SOE-PCR）要求设计P4、P5，其中P4的5′端序列与cat基因序列同源，3′端序列与lpxE基因序列同源。再根据GenBank上发布的E.coli lpxM基因序列，设计2对引物，P7、P8位于E.coli J5株中的lpxM基因ORF的上下游外翼，用于扩增检测lpxM基因及其缺失突变株。另外，在P7、P8内侧设计1对同源重组引物P9、P10，其5′端序列与lpxM两翼序列同源，3′端序列与cat基因序列同源。引物由北京擎科生物技术有限公司合成，引物序列见表1。

1.3.2 Red重组构建J5ΔlacI：：lpxE 为将lpxE基因插入细菌基因组并常量表达，试验选择lac操纵子中抑制子lacI基因作为插入位点，利用Red重组技术用lpxE基因置换lacI基因。

PCR反应1以F.novicida基因组为模板，P3、P4为引物，扩增lpxE基因;反应2以质粒pKD3为模板，P5、P6为引物，扩增cat基因。反应1和反应2按照常规PCR的方法进行操作，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后通过DNA胶回收并送北京擎科生物技术有限公司进行测序鉴定。SOE-PCR以反应1和反应2的产物为模板，P3和P6为引物，按照文献[10]方法，分2轮PCR扩增lpxE-cat重组片段。最后产物经DNA胶回收后-20 ℃冻存备用。

按照文献[11]中的方法向已经导入pKD46的J5株感受态细胞中電转lpxE-cat重组片段，通过氯霉素抗性平板筛选1次同源重组菌J5ΔlacI：：lpxE-cat，并进行PCR鉴定。然后向阳性菌种导入编码Flp重组酶的质粒pCP20，通过对Flp位点的识别消除抗性基因，获得二次重组菌J5ΔlacI：：lpxE，利用P1、P2引物扩增目的片段，送北京擎科生物技术有限公司进行测序鉴定。

1.3.3 Red重组构建J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM 以构建的J5ΔlacI：：lpxE重组株为出发菌株，继续构建lpxM缺失株。以pKD3为模板，P9、P10为引物，按照文献[11]方法扩增cat基因，DNA胶回收后-20 ℃冻存备用。重组的具体方法同“1.3.2”节，分别通过一次重组和二次重组构建J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM重组株，利用P7、P8引物扩增目的片段，送北京擎科生物技术有限公司进行测序鉴定。

1.4 β-半乳糖苷酶试验检测lac操纵子的表达

β-半乳糖苷酶试验参照文献[12]进行。将J5株和J5△lacI：：lpxE重组株分别接种4 mL于装有LB液体培养基的试管，放置在摇床中，37 ℃、180 r/min 培养细菌8 h。收集菌液，10 000 r/min离心10 min，取培养上清备用。按照文献[13]方法，配制0.02 mol/L ONPG底物溶液，过滤除菌，分装成1 mL/管。分别在每管中加入100 μL的培养上清，另设置1管加入PBS作为空白对照，放置在37 ℃水浴锅中共孵育6 h，观察底物溶液颜色变化。

1.5 细菌LPS的提取和纯化

细菌LPS的提取和纯化按照文献[14]进行。挑取J5株及重组株至LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min 培养过夜，并转接至500 mL细菌培养液中扩大培养8 h。收菌时检测菌液的吸光度D600 nm。菌液6 000 r/min离心20 min，并以1 ∶ 10比例浓缩。浓缩菌液在-20 ℃下反复冻融3 次;加入溶菌酶（含50 μg/mL），37 ℃水浴60 min。低温条件下超声破碎菌体，之后将菌液移至200 mL玻璃瓶中，在68～70 ℃下预加热，加入新配制的等体积90%苯酚（体积分数），68～70 ℃下反应30 min，期间每 5 min 摇晃振荡样品，使反应充分进行。结束后将混合液转移至离心杯中，并保存于 4 ℃ 过夜。次日 3 000 r/min 离心样品30 min后取上清，在剩余酚相中加入等体积的ddH2O，重复提取1次，合并2次水相，并移至透析袋中。充分透析去除苯酚后，使用聚乙二醇（PEG 8000）浓缩，使体积至原液的1/5～1/6。将透析袋内浓缩液吸出，离心（4 ℃，3 000 r/min，30 min）取上清，即为LPS粗制品。

在LPS粗制品中加入DNase I和Rnase A，37 ℃水浴60 min，然后置于65 ℃下10 min灭活酶。之后5 000 r/min离心10 min，去除沉淀，将上清冻干处理，得到LPS冻干粉。冻干粉称质量，计算得率，并加入灭菌ddH2O复溶，配制成1 mg/mL的LPS纯品。

1.6 鲎试剂检测LPS活性

按照鲎试剂盒说明书的方法配制内毒素标准溶液，按比例稀释1.5倍，获得LPS待测样品，根据说明试验步骤进行显色，使用全波长酶标仪测定545 nm波长处的吸光度，根据读值结果建立内毒素浓度标准曲线，并计算LPS样品的活性。

1.7 动物试验检测LPS毒性

选取20 g ICR雌鼠40只，10只/组进行分组，设置3个试验组和1个对照组。稀释1.5倍，获得J5、J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM和DH5α的LPS提取物至500 μg/mL，试验组分别腹腔注射不同LPS提取物（剂量5 mg/kg），注射量为200 μL/只，空白对照组注射200 μL PBS。观测攻毒后小鼠的生理精神状态（食欲、饮欲及活动状况等）和病症，并在攻毒2 d后剖杀小鼠，取肝脏制作石蜡切片，观察其组织病理变化从而判定不同LPS提取物的毒性强弱。

2 结果与分析

2.1 J5Δlac I：：lpxEΔlpxM重组株的鉴定

将二次重组菌制备基因组模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增鉴定，对照野生型扩增片段为 1 200 bp，重组菌扩增片段为888 bp（图1），PCR产物测序结果正确。以P7和P8为引物进行PCR扩增lpxM基因鉴定，对照野生型扩增片段为 1 066 bp，重组菌扩增片段为179 bp（图2），PCR产物测序结果正确，命名重组菌为J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM。

2.2 β-半乳糖苷酶试验检测lac操纵子的表达

由图3可知，J5野生菌和J5ΔlacI：：lpxE培养上清分别加入底物ONPG孵育后，J5野生菌培养液不变色;J5ΔlacI：：lpxE培养液显黄色，说明重组株lac操纵子可正常转录表达，lpxE基因置换lacI成功。

2.3 脂多糖产量比较

J5株及重组株的LPS水溶物均为无色透明液，冻干后为白色粉末状。根据LPS冻干产物称质量的结果，计算出得率，见表1。

2.4 内毒素活性检测

鲎试剂中含有能被微量细菌内毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，是一种凝固蛋白原，能准确、快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素[8-9]。根据定量试剂盒标准品形成的标准曲线的计算公式为Y=0.819 0X+0.305 2，r2=0.990 2。推算测得DH5α的LPS活性为2.3×105 EU/mg，J5原菌的LPS活性为1.7×105 EU/mg，改造菌株J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM的LPS活性为4.3×103 EU/mg。改造菌株J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM的LPS活性较DH5α和J5原菌显著降低，说明重组菌株改造成功。

2.5 LPS毒性試验结果

2.5.1 临床症状 通过对小鼠分别依次腹腔注射野生株J5，突变株J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM以及DH5α的LPS，结果发现，大肠杆菌J5和DH5α的LPS提取物攻毒组，小鼠被毛凌乱、精神抑郁、有明显毒性反应;而PBS组和J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM的LPS提取物组的小鼠正常，无任何临床症状。说明经改造的突变株J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM的LPS毒性明显降低。

2.5.2 组织病理变化 对攻毒小鼠的肝脏组织进行病理切片，由图4可知，DH5α组和J5组的肝脏细胞肿胀，细胞间隙增大，同时出现不同程度的炎性细胞浸润。相对于DH5α组和J5组，J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM组肝脏细胞与PBS组的肝脏细胞形态一致，没有明显的病理变化，仅发生局部炎性细胞浸润。说明改造后的J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM突变株的毒性减弱。

3 结论与讨论

细菌LPS会最大程度地激活机体TLR4、Notch[15]通路， 引起细胞毒性反应。已有研究表明，

改变脂肪酸链的数量、长度以及磷酸基团个数均可降低LPS的毒性，使其发挥佐剂作用[16]，其中，MPLA作为类脂A的结构变体，是一种免疫效力显著的佐剂物质。其传统的生产方法是收获R型沙门菌突变株R595的LPS，并对其LPS采用酸解、碱解等一系列繁琐的化学手段脱去磷酸基团及酰基链获得。但该类产物的产率较低，MPLA纯度无法保障，存在多种不同的阳离子使其溶解度降低，可能发生沙门菌污染，生产成本极高。

本研究选用O抗原不完全的大肠杆菌J5疫苗株作为出发菌，利用λ-Red同源重组技术，从生物合成学的角度对细菌完成基因改造，使细菌直接合成MPLA。其中非常重要的改造位点是导入可以去除磷酸基团的弗朗西斯菌的lpxE基因并保证常量表达，因此笔者所在课题组选择lac操纵子中常量表达的lacI基因作为重组位点。lacI具备独立的启动子，可在非乳糖培养环境下常量表达，J5野生菌中β-半乳糖苷酶LacZ在抑制子LacI的作用下转录被阻遏;当lacI基因的ORF被完成置换为lpxE的ORF后，细菌常量表达LpxE而非LacI，原阻遏效应结束，LacZ则开始转录表达并催化底物ONPG，显示黄色;同时，常量表达的LpxE也保证了细菌LPS可以被催化转变为MPLA结构。

导致腹泻的野生猪源大肠杆菌LPS的活性可以达到1.21×107 EU/mg，Sigma公司市售的LPS活性约为1×105 EU/mg[17]。而本研究中使用的大肠杆菌J5株由于其自身作为疫苗株的安全性优势，经笔者所在课题组测定LPS活性仅1.7×105 EU/mg，显著低于猪源野生大肠杆菌。但从小鼠的毒性试验结果可以发现，J5株的LPS仍然可以引起小鼠包括被毛凌乱、精神抑郁等临床反应，肝脏组织也存在明显的病变。相对于J5野生株以及DH5α，经改造J5菌株的LPS提取物对小鼠没有造成明显的临床症状，且肝脏组织切片也确定没有明显病变，说明该改造菌株的MPLA毒性显著低于原野生株，该改造菌株更安全。

尽管本研究已经成功构建了J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM重组菌，但是其产生的MPLA的佐剂效力仍有待进一步通过动物免疫试验验证和评估。而利用基因重组改造菌株生产并提取MPLA的技术思路，可以直接减少原生产的化学工艺流程中酸解和碱解的步骤，提高产品纯度和产率，显著降低生产成本，从而将廉价、高效的MPLA佐剂应用于兽用疫苗。

参考文献：

[1]Wang X Y，Quinn P J. Endotoxins：structure，function and recognition[M]. Berlin：Springer，2010.

[2]Gregg K A，Harberts E，Gardner F M，et al. Rationally designed TLR4 ligands for vaccine adjuvant discovery[J]. Mbio，2017，8（3）：e00417-e00492.

[3]Schülke S，Flaczyk A，Vogel L，et al. MPLA shows attenuated pro-inflammatory properties and diminished capacity to activate mast cells in comparison with LPS[J]. Allergy，2015，70（10）：1259-1268.

[4]Tomita G M，Todhunter D A，Hogan J S，et al. Immunization of dairy cows with an Escherichia coli J5 lipopolysaccharide vaccine[J]. Journal of Dairy Science，1995，78（10）：2178-2185.

[5]Abdulaziz T A. Elsukhon S N. Chickens hyperimmunized with Escherichia coli J5 strain are protected against experimental challenge with Escherichia coli O78 serotype[J]. Veterinary Research Communications，1998，22（1）：7.

[6]Aslam M，Whitemore H L，Kakoma I. Effect of E.coli J5 vaccine and intramammary challenge with live Escherichia coli in lactating dairy goats[J]. Small Ruminant Research，1995，17（3）：275-281.

[7]王 刚. E.coli J5菌苗对兔实验性感染巴氏杆菌的保护作用[J]. 预防兽医学进展，2000（3）：48-49.

[8]李颜颜. 弗朗西斯菌类脂A的结构多样性及其分子机制研究[D]. 无锡：江南大学，2012.

[9]李颜颜，史 锋，李 烨，等. 细菌类脂A结构与功能研究进展[J]. 微生物学报，2008，48（6）：844-849.

[10]Horton R M，Cai Z L，Ho S N，et al. Gene splicing by overlap extension：tailor-made genes using the polymerase chain reaction，BioTechniques，1990，8（5）：528-535.

[11]郭志燕. FimA介导F18ab+大肠杆菌病原性的研究[D]. 扬州：扬州大学，2014.

[12]胡会杰，周明旭. 猪源产肠毒素大肠杆菌eltA、flhD、fimA、faeG基因启动子的预测，克隆和鉴定[J]. 中国兽医学报，2015，35（10）：1640-1645.

[13]Buelow P. The ONPG test in diagnostic bacteriology. Comparison of the ONPG test and the conventional lactose-fermentation test[J]. Acta Pathologica et Microbiologica Scandinavica，1964，60（3）：387-402.

[14]Li Y，Powell D A，Shaffer S A，et al. LPS remodeling is an evolved survival strategy for bacteria[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，2012，109（22）：8716-8721.

[15]朱丽华，熊御云，夏 琳，等. 积雪草酸预处理对脓毒症小鼠急性肾损伤的影响及机制[J]. 山东医药，2017，57（30）：10-13.

[16]Kanistanon D，Hajjar A M，Pelletier M R，et al. A francisella mutant in lipid a carbohydrate modification elicits protective immunity[J]. PLoS Pathogens，2008，4（2）：e24.

[17]馮 将，王玉坤，魏玉好，等. 猪源大肠杆菌脂多糖的提取、纯化及活性分析[J]. 中国畜牧兽医，2017，44（3）：912-919.