宁金卓，程帆，余伟民，李浩勇，饶婷，阮远

(武汉大学人民医院泌尿外科,武汉 430000)

肾缺血再灌注损伤(IRI)经常发生于失血性休克、肾移植、大血管手术等，可引起急性肾损伤，甚至急性肾衰竭[1]。虽然再灌注对于缺血性组织的存活是必不可少的，但有证据表明再灌注本身会引起细胞损伤，导致细胞最终死亡[2]。大蒜素是大蒜主要的生物活性成分，研究表明大蒜素有抗癌、抗动脉粥样硬化、抗高血压、抗炎、抗凋亡和降脂等药理作用[3-5]。大蒜素还被报道具有抗氧化和保护脑缺血性损伤的作用[6]。本研究旨在研究大蒜素对肾脏IRI实验模型保护作用及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验试剂及器材 大蒜素,天津子涵生物科技有限公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒,南京建成生物工程研究所；原位细胞凋亡检测试剂盒，德国罗氏生物技术有限公司；免疫组织化学检测试剂盒，上海研卉生物科技有限公司；RNA 提取试剂盒及逆转录试剂盒,广州威佳科技有限公司；Bax、Bcl-2、caspase-3和Cyt-C抗体，加拿大圣克鲁斯公司。

1.2 方法

1.2.1 实验动物与分组 40只健康雄性成年Wistar大鼠，体质量250～300 g，购于湖北省疾病预防控制中心,实验获武汉大学动物实验伦理委员会批准。动物饲养于武汉大学人民医院实验动物中心,允许自由饮食和饮水。大鼠经腹腔注射2.0%苯巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，然后放置在恒温设备上，保持直肠温度为37～38 ℃。大鼠随机分为以下4组,每组10只。(1)假手术组(A组)：暴露左侧肾脏，仅游离左侧肾蒂，不给予任何干预措施，暴露45 min 后缝合切口；(2)假手术+大蒜素组(B组)：A组基础上腹腔注射50 mg/kg大蒜素进行干预；(3)肾脏IRI组(C组)：行腹部中线切口，用钝性分离左侧肾动脉和静脉，用无创血管钳夹闭左侧肾蒂45 min，阻断后可见被阻断区肾叶颜色由鲜红色变为暗红色表明肾脏缺血成功，取下无创血管夹恢复肾脏血液供应，缝合切口关腹；(4)肾脏IRI+大蒜素组(D组)：C组基础上,于再灌注同时腹腔注射50 mg/kg大蒜素进行干预。

1.2.2 肾脏病理 肾脏组织标本用0.9%氯化钠注射溶液冲洗干净后，置于4%的甲醛溶液中固定，石蜡包埋,切片厚度4 μm，然后进行组织脱蜡、水化，用苏木精和伊红(HE)染色。

1.2.3 MDA和SOD测定 肾脏组织匀浆离心(3000 r/min,10 min)，收集上清液。用黄嘌呤氧化酶法测定SOD，用硫代巴比妥酸(TBA)法测定MDA，实验重复3次。操作按照说明书进行。吸光度在532 nm处检测MDA水平，单位为 nmol/g 蛋白。吸光度550 nm处测定SOD活性，单位为u/mg 蛋白。

1.2.4 肾小管上皮细胞凋亡 细胞凋亡检测采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法，TUNEL阳性细胞显示细胞核染成棕黄色。光镜下(×200)每张切片选取10个视野，生精细胞的凋亡指数(AI)=阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.2.5 免疫组织染色 Bax和caspase-3的表达采用免疫组织化学染色分析。石蜡切片脱蜡至水并浸泡于蒸馏水中，高温高压修复后冷却至室温，转入TBS缓冲液中，冲洗3次，每次5 min。3%过氧化氢室温20 min阻断内源性过氧化物酶，TBS冲洗3次，每次5 min。10%山羊血清孵育20 min，甩去血清，滴加一抗Bax，caspase-3后37 ℃孵育40 min。孵育完TBS冲洗3次，每次5 min。每张切片滴加二抗，37 ℃孵育20 min，TBS冲洗3次，每次5 min。甩去TBS，采用Image-Pro Plus 6.0 进行免疫组织化学的图片分析。

1.2.6 Western Blot检测 剪碎肾脏组织匀浆裂解，4 °C下12 000 r/min离心5 min取上清。取20 μg样品上样电泳，随后80 V电转2 h至PVDF膜上。室温下，5%脱脂牛奶摇床上封闭1 h，分别加1∶100稀释的抗Cyt-C 抗体(sc13156;Santa Cruz,CA)和1∶200稀释的抗Bcl-2抗体 (sc7382;Santa Cruz,CA)，在4 °C过夜进行抗体孵育。TBST洗膜3次，每次5 min，标记羊抗鼠二抗在室温下孵育1 h。TBST洗膜3次，每次5 min，使用ECL试剂显示蛋白条带并拍照，使用Image J 成像分析软件对结果进行半定量分析。

1.2.7 实时荧光定量(Real time-PCR)测定 采用Trizol法提取肾脏组织样本总RNA，依操作说明取RNA 2 μg逆转录成cDNA。反应条件为：逆转录50 ℃ 15 min，95 ℃ 40 s；循环条件为：95 ℃ 30 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 45 s，40个循环(预变性，变性，退火，延伸)。引物序列：Bax正义链5′TGAACTGGACAACAACATGGAG3′,反义链5′AGCAAAGTAGAAAAGGGCAACC3′；Bcl-2正义链5′TTTGATTTCTCCTGGCTGTCT3′，反义链5′CTGATTTGACCATTT GCCTG3′；caspase-3正义链5′-TGGACTGCGGTATTGAGACA-3′，反义链5′-GCGCAAAGTGACTGGATGAA-3′；Cyt-C正义链5′-TTGACGGACCCCAAAAGATG-3′，反义链5′-AGAAGGTGCTCATGTCCTCA-3′；GAPDH正义链5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，反义链5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′。实验测定所得Ct值即为mRNA表达水平，用2-△△Ct法得出各组样品mRNA相对表达水平。

2 结果

2.1 肾脏组织的病理学改变 A组和B组未见明显的组织病理学改变，可见肾小管上皮细胞结构清晰，无明显变性、坏死；C组可见肾小管扩张和充血,肾小管上皮细胞肿胀和坏死，部分管腔狭窄；与C组相比，D组可见肾小管上皮细胞损伤减轻，可见部分肿胀、变性,且管腔狭窄程度也较轻(图1)。

2.2 肾脏组织中氧化应激水平 结果显示，与A组和B组相比，C组中MDA含量显著升高而SOD活性下降，差异有统计学意义(P<0.05)；另外，与C组相比，D组中MDA含量明显下降而SOD活性显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 Wistar大鼠肾脏组织中MDA

2.3 肾小管上皮细胞凋亡情况 A组和B组中可见较少的、散在的肾小管上皮细胞凋亡；C组中凋亡细胞显著增加，染色阳性细胞以远端肾小管上皮细胞多见,与A组[AI：(4.24±0.85)%]和B组[AI：(4.28±0.82)%]相比，差异有统计学意义(P<0.05)；D组[AI：(12.25±1.27)%]细胞凋亡较C组[AI：(23.67±1.88)%]明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 肾脏组织中Bax和caspase-3免疫组织化学 Bax,caspase-3在A组和B组中仅可见肾小管上皮细胞散在的阳性表达；C组中阳性表达明显增多，表现为细胞质和细胞核呈现为黄色或棕黄色；D组中阳性表达较C组明显减少(图2)。

图2 Wistar大鼠肾脏组织中Bax和caspase-3免疫组织化学结果(×200)：A为假手术组；B为假手术+大蒜素组；C为肾脏IRI组；D为肾脏IRI组+大蒜素组

2.5 肾脏组织中Bcl-2和Cyt-C蛋白表达 Western Blot法检测肾脏组织中Bcl-2和Cyt-C蛋白水平。结果显示，与A和B组比较，C组中Cyt-C蛋白表达水平增加，而Bcl-2蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)；另外，与C组相比，D组中Cyt-C蛋白含量显著下降，Bcl-2蛋白表达水平明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 Wistar大鼠肾脏组织中Bcl-2和Cyt-C蛋白表达水平

2.6 肾脏组织中Bax、Bcl-2、caspase-3和Cyt-C mRNA的表达 RT-PCR法检测肾脏组织中Bax、Bcl-2、caspase-3和Cyt-C mRNA的表达水平。结果可见，与A组和B组比较,C组中Bax、caspase-3和Cyt-C mRNA表达水平明显增加，Bcl-2 mRNA表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与C组相比，D组中Bax、caspase-3和Cyt-C水平明显下降，Bcl-2表达水平明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 Wistar大鼠肾脏组织中Bax、Bcl-2、caspase-3和Cyt-C mRNA的表达水平

3 讨论

肾脏受到手术、创伤、休克或其他损伤时，常引起肾脏IRI。血液供应重新建立，会导致活性氧的过度生成，可以改变细胞中蛋白质、脂质、核糖核酸的性质，造成细胞功能障碍甚至死亡[7]。而坏死的细胞引起炎症级联反应的激活，导致更严重的继发性组织损伤[8]。针对肾脏IRI早期的治疗具有重要意义。

大蒜素具有多种药用功能，常用于治疗多种疾病。Chen等[9]报道了大蒜素通过抑制氧化应激保护H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡；Kong等[6]研究发现大蒜素对缺血再灌注脑损伤的保护作用，可能与减少自由基和炎性因子的产生有关；研究认为氧化应激可通过缺血阶段线粒体呼吸链的功能障碍而触发，并在再灌注期被放大，导致直接损伤DNA、蛋白质、脂质而引起细胞损伤[10]。正常情况下，代谢过程中产生的活性氧可以被内源性抗氧化酶如SOD清除，过量的ROS生成和抗氧化能力的降低导致肾损伤加重[11]。MDA作为脂质氧化的重要产物。降低MDA水平和SOD活性的降低对心脏IRI具有保护作用[12]。本研究表明，大蒜素可明显使IRI肾脏组织中的MDA含量降低，SOD活性升高，从而减轻肾脏氧化应激反应，增加抗氧化能力，减低肾脏组织学的损伤。

细胞凋亡在肾脏IRI的病理过程中有重要的作用[13]。Bcl-2作为抗凋亡蛋白，能抑制脂质过氧化物的形成及内质网Ca2+释放和自由基的产生[14]。Bax是Bcl-2的内源性拮抗剂，促进细胞凋亡[15]。在生理状态下，Bcl-2和Bax的表达保持平衡。缺血再灌注通过增加Bax蛋白表达水平和降低Bcl-2蛋白水平来激活细胞凋亡[16]。caspase的激活是细胞凋亡的另外一个显著特征，其参与哺乳动物细胞凋亡细胞程序的启动和执行[17]。caspase-3由32 kDa酶原形成，通过凋亡配体和线粒体途径裂解为活性17 kDa亚基，这是一种关键的效应因子caspase，它在细胞凋亡的最后阶段开始降解细胞[18]。过量的ROS同时激活线粒体和内质网应激通路，当线粒体受损时，Bax的增加和Bcl-2的减少改变了线粒体外膜中Bax和Bcl-2的比例，促进细胞色素C(Cyt-C)的释放；Cyt-C激活凋亡效应蛋白caspase-3，最终诱导线粒体依赖性细胞凋亡[19]。本研究表明，IRI组中,细胞凋亡明显增高；经大蒜素干预后，细胞凋亡较IRI组明显降低；大蒜素在肾脏IRI中发挥了抗凋亡的作用。

总之，本研究证明大蒜素对大鼠肾脏IRI具有抗凋亡和抗氧化作用。但大蒜素对损伤的肾脏有保护作用的具体机制有待进一步阐明。