蒋雨薇,张梓卉,曾铭华,党小红,刘习明,张 妍

(长沙生殖医学医院，湖南 长沙 410205)

卵泡细胞反映了卵母细胞的整体健康状况以及胚胎的后续发育能力。颗粒细胞与单个卵母细胞相关的生物标志物可用于辅助生殖预测何种胚胎最有可能植入子宫并完成妊娠。本综述中，我们对近年来涉及胚胎发育和妊娠有关的人卵泡颗粒细胞生物标志物进行了汇总，对其微阵列数据和定量RT-PCR验证表达基因的研究进行了评估，提示颗粒细胞生物标记物有助于识别成熟卵母细胞以期提高妊娠和活产率。

在过去三十年中我国辅助生殖技术虽然有所改进，但不孕患者妊娠率和活产率仍不理想。对于未来的发展，提高胚胎选择及植入率是提高生育治疗效率的关键。使用激素疗法来诱导排卵以及其他用于生产胚胎的技术包括IVF、ICSI、IMSI及捐赠卵子等改进的空间不大。缺乏客观、准确和无创的胚胎评估策略仍然是体外受精面临的主要挑战之一。随着胚胎发展实时检测技术及PGD/PGS技术的出现，胚胎选择成为生育治疗最有发展前景的领域。颗粒细胞反映了卵母细胞的特性，为评估卵母细胞质量提供了一种无创手段。近年来，应用qRT-PCR和微阵列技术，一些研究将颗粒细胞基因表达的变化与胚胎发育和妊娠结局联系起来。本综述主要评估卵泡颗粒细胞的生物标志物来预测选择胚胎以期提高体外受精妊娠的成功率。

1 颗粒细胞生物标志物筛选

卵母细胞和颗粒细胞之间缝隙连接和旁分泌通讯的相互作用系统为卵母细胞的发育、排卵、受精和随后的植入创造了最佳条件。目前的研究拟用颗粒细胞的基因表达谱识别产生高质量胚胎的卵母细胞，以非侵入性的方式准确地反映卵母细胞的生育潜能。颗粒细胞基因标志物的研究选择有不同端点，包括卵母细胞核成熟期、受精期、第2～3天胚胎期、第5～6天囊胚期、着床期、妊娠和活产期，并根据妊娠结局确定胚胎质量和能力。迄今发表的研究表明，qRT-PCR作为一种敏感和有效的方法，广泛应用于单个转录样本的定量。另一方面，利用微阵列技术进行全基因组表达谱分析，为研究人员开辟了一个新的视角，有望鉴定出可行胚胎的转录标志。

2 颗粒细胞标记物与卵母细胞胚胎发育相关的微阵列及qRT-PCR分析

卵母细胞的发育能力是其恢复成熟、成功受精和达到囊胚期的能力。这种能力是通过与卵泡的体细胞相互作用而获得的。卵丘和颗粒细胞支持卵母细胞的发育，而卵母细胞则影响卵泡细胞的生长和分化。研究表明，卵泡刺激素和黄体生成素通过蛋白激酶A(PKA)和C(PKC)在颗粒细胞中启动信号，在卵母细胞能力获得中起重要作用。Tremblay PG等采用基因芯片和RT-qPCR技术，观察PKA和PKC刺激对颗粒细胞瘤基因表达的影响[1]。蛋白激酶驱动的信号涉及五个主要的上游调节，即表皮生长因子(EGF)[2]，转化生长因子β1(TGFβ1)[3]、血管内皮生长因子(VEGF)[4]，碱性成纤维细胞生长因子(FGF 2)[5]和肝细胞生长因子(HGF)[6]。与7种主要卵巢功能相关的基因有：炎性反应[7-8]包括前列腺素内切酶2(PTGS2)，白细胞介素8(IL-8)和白细胞介素6(IL-6)；类固醇生成[9-11]包括立体致敏的急性调节蛋白(STAR)、细胞色素P450家族11亚家族A成员1(CYP11A1)，以及细胞色素P450家族19亚家族A成员1(CYP19A1)；血管生成[12-14]包括血管内皮生长因子C(VEGFC)、血管内皮生长因子A(VEGFA)和血管生成C-X-C趋化因子受体四型(CXCR 4)；分化[15-16]包括表皮生长因子(AREG)，表皮生长因子受体(EGFR)和RTK信号拮抗剂2(SPRY 2)；细胞凋亡[17-19]包括BCL 2相关联X(bax)，bcl-样蛋白12(Bcl2L12)和半胱天冬酶1(CASP 1)；基质[20-21]包括细胞周期蛋白D1(CCND 1)，细胞周期蛋白B1(CCNB 1)，细胞周期蛋白B2(CCNB 2)；排卵[22-23]包括金属蛋白酶1(MMP1)、金属肽酶9(MMP 9)和TIMP金属蛋白酶抑制剂1(TIMP 1)。

在研究颗粒细胞基因表达与体外胚胎发育的关系的研究中，McKenzie等人评估了在108个人卵泡颗粒细胞中与卵母细胞成熟、受精和胚胎质量相关的HAS2、PTGS2和GREM1[24-27]。结果发现，PTGS2和HAS2在发育为高级别胚胎的卵母细胞周围的颗粒细胞中的表达增加了6倍，GREM1的表达增加了15倍。应用qrt-PCR技术，对单个卵母细胞的颗粒细胞进行了检测，发现颗粒细胞在卵母细胞中显著表达PTGS2。van Montfoort等人进行了基因芯片实验，比较了8个卵子早期卵裂胚胎和8个非早期卵裂胚胎卵母细胞中的基因表达[28]，结果显示，共有611个基因有差异表达，这些基因参与了许多生物学过程，包括细胞周期、血管生成和凋亡等。在已鉴定的基因中，细胞周期蛋白D2(CCND 2)[29]、趋化因子受体4(CXCR 4)[14]、谷胱甘肽过氧化物酶3(GPX 3)[30]、钙黏素相关蛋白1(CTNND 1)[31]、7-脱氢胆固醇还原酶(DHCR 7)[32]、紊乱节段极性蛋白3(DVL 3)[33]、热休克27 kDa蛋白1(HSBP 1)[34]和三重基序28(TRIM 28)[35]是qrt-PCR分析证实的最重要的基因。这些基因表达的改变被认为是非早期卵裂胚胎缺氧状态或卵母细胞成熟延迟的标志。随后，Assou等人提出了一种基于微阵列基因表达谱的比较[36]，从而获得了630个差异表达基因研究的鉴定结果。经qRT-PCR证实bcl-样蛋白11(BCL2L11)[37]和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1(PCK 1)[38]表达上调，核因子IB(NFIB)[39]表达下调。这些基因有较高的表达水平，提示颗粒细胞的转录激活对胚胎的发育能力至关重要。以上结果表明颗粒细胞的转录组分析有助于识别卵母细胞发育状态，可能作为新的无创标记而替代入侵诊断试验的方法。

3 颗粒细胞标记物与妊娠能力相关的微阵列及qRT-PCR分析

在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)中，应考虑基因表达分析，以确定可能导致妊娠的卵母细胞[40]。Hamel等人的三项连续研究报告了妊娠结局与颗粒细胞转录体之间的关系[41-43]。在其研究中，使用cDNA微阵列和基因芯片，对颗粒细胞的基因表达进行了分析。从代表孕妇和非孕妇患者的集合样本中提取的消减文库中提取定制微阵列包含颗粒细胞表达的序列标签(EST)。在115个差异表达基因中，3-β-羟色胺脱氢酶(HSD 3β1)[44]的表达发生了改变，铁氧还蛋白1(FDX 1)[45]，丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂类成员2(SERPINE2)[46]、细胞色素P450芳香化酶(CYP19A1)[11]和细胞分裂周期42(CDC42)[47]与妊娠结局显著相关。利用这项初步研究的结果，研究人员随后确定了磷酸甘油酸激酶1(PGK 1)[48]、G蛋白信号调节因子(RGS 2、RGS 3)[49-50], CDC42和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶2(UGP 2)[51]以及血小板-白细胞C激酶底物同源结构域A族成员1(PHLDA 1)[52]，作为与胚胎质量相关致妊娠成功的潜在标记。

综上所述，与卵母细胞相关的颗粒细胞是鉴定生物标志物的有价值的来源，从而可靠地选择能够导致活产的胚胎。在评估颗粒细胞转录学的研究中所发表的结果显示，对颗粒细胞作为卵母细胞胚胎发育和质量标记物的共识是有限的。这可能是由于实验室环境、研究结果指标、研究群体的规模和利用技术的变化造成的。此外，在评估卵泡颗粒细胞有关胚胎质量和其他生殖终点的微阵列和qRT-PCR数据时，主要的困难之一是患者群体的异质性。影响体外受精结局和基因表达的患者特征包括年龄、体重指数(BMI)、诊断、刺激类型、刺激过程中的激素水平和卵母细胞产量等，因此选择患者是鉴别颗粒细胞预测妊娠的生物标记物的关键。由于IVF患者在寻找潜在的生物标志物时要考虑许多不同的特点，逐步多因素分析可能是选择子宫移植胚胎最有希望的方法。虽然许多研究都集中在授精成熟卵母细胞的结果上，但在子宫移植时并不能保证被评估的胚胎在基因上是正常的。颗粒细胞转录与植入前遗传筛查PGS的结合可能是改善子宫移植胚胎选择的下一步，因为这将认可胚胎倍性状态及基因表达生物标志物与活产的关系。颗粒细胞生物标志物也可能有更多的应用，鉴于许多成熟卵母细胞在形态上相似，颗粒细胞生物标记物有助于识别成熟卵母细胞。在将来，颗粒生物标志物可能会在卵母细胞受精之前进行评估，只选择那些能够导致活产的卵母细胞去受精，以期提高妊娠和活产率。