牛金利，佘琳曼，李达怡，黄妙容，罗燕珊，黄锦杏，明月月，马 驿，彭金菊

(广东海洋大学农学院动物医学系，广东 湛江 524088)

巴氏杆菌(Pasteurella)是一种人兽共患病的病原菌，分布广泛，是农场和野生动物主要呼吸系统感染病原体之一[1]。主要通过呼吸道和消化道感染，引发的疾病死亡率高，严重危害动物以及人类的健康[2]。中药被广泛应用于畜牧生产，历史悠久，在防治畜禽疾病方面，其具有抗菌消炎、无残留、不易产生耐药性等优点[3]。抗生素一直被用于治疗细菌感染性疾病。大量的临床实践及药理研究表明，合理的中西药联合能够提高疗效，减少耐药性以及毒副作用的产生，但中药的化学成分相对复杂，药理作用尚不明确，联合使用不当可能会导致疗效降低，副作用增多，严重时甚至危害生命[4]，因此需通过试验观察验证中药和中西药联用是否有效。为了筛选出抑菌活性高、安全、毒副作用小的药物用于防治巴氏杆菌病，本试验利用微量肉汤二倍稀释法、微量肉汤稀释棋盘法测定单药和药物联合的体外抑菌效果，选取体外抑菌效果较好的中药和抗生素，通过灌服给人工感染巴氏杆菌的小鼠，观察单药和联合用药对其防治效果，为以后联合用药的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株 巴氏杆菌(C48-3)，由中国兽医药品监察所提供。

1.2 中药和抗菌药 香附、黄连、山药、山银花、益母草、决明子，均购自湛江市中医院。阿莫西林、硫酸新霉素、盐酸多西环素、氟苯尼考、替米考星、恩诺沙星、头孢噻呋钠，均购自深圳容金科技有限公司。

1.3 实验动物 BALB/c小鼠200只，体重约25～35 g，雌雄各半，购自广东医科大学实验动物中心。

1.4 菌液的制备 挑取适量的标准菌株粉末接种于鲜血琼脂培养基，37 ℃培养箱中培养16～24 h后，挑取单个菌落接种于营养肉汤中，37 ℃培养16～24 h， 采用平板计数法用营养肉汤把细菌浓度稀释至105CFU/mL。

1.5 中药水提物的制备 采用水煎法提取中药，将香附、黄连、山药、山银花、益母草、决明子等各味中药分别加热煮沸30 min，过滤，连续煎煮3次，冷却，过滤，合并煎煮药液，浓缩药液至相当于含生药1 g/mL。

1.6 抗菌药药液的制备 将阿莫西林、硫酸新霉素、盐酸多西环素、氟苯尼考、替米考星、恩诺沙星、头孢噻呋钠等分别配成1 280 μg/mL。

1.7 中药对巴氏杆菌最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定 采用试管二倍稀释法[5]测定各个中药对巴氏杆菌的MIC，取试管12支，于各试管中加入菌液和药液，12支试管的中药含量分别为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391、0.196、0 mg/mL。37 ℃培养16 h观察结果。37 ℃培养24 h后划线于营养琼脂培养基，37 ℃培养24 h观察结果，没有细菌生长且中药浓度最小，即为该中药对该菌株的MBC。

1.8 抗菌药对巴氏杆菌MIC和MBC的测定 采用微量肉汤稀释法[6]，测定各个抗菌药对巴氏杆菌的MIC，取96孔板，于各孔中加入菌液和药液，使每排12孔中的药物含量分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0 μg/mL。37 ℃培养16 h观察结果。MBC的测定方法与中药MBC的测定方法相同。

1.9 中西药联合MIC和MBC的测定 选取对巴氏杆菌体外抑菌效果最好的中药抗菌药，采用棋盘法[7]测定其联合后对巴氏杆菌的抑菌效果。

FIC≤0.5为协同作用；0.52为拮抗作用。

1.10 小鼠人工感染巴氏杆菌的防治试验

1.10.1 试验分组 将小鼠随机分成5组，每组20只。给药剂量由体外抑菌试验测得的MIC、MBC确定。Ⅰ 组为感染细菌的阳性对照组；Ⅱ组为不感染细菌的阴性对照组；Ⅲ组为中药香附组，预防组和治疗组用量分别为25 mg/(g·d)和50 mg/(g·d)；Ⅳ组为抗菌药恩诺沙星组，预防组合治疗组用量分别为0.5 μg/(g·d)和1 μg/(g·d)；Ⅴ组为香附与恩诺沙星联合组，预防组用药量香附25 mg/(g·d)、恩诺沙星0.5 μg/(g·d)，治疗组用药量为香附50 mg/(g·d)、 恩诺沙星1 μg/(g·d)。其给药方式均为灌服。

1.10.2 人工感染试验 用营养肉汤将巴氏杆菌稀释成所需浓度，通过皮下注射不同浓度的菌液0.1 mL，筛选能引起小鼠死亡的巴氏杆菌菌液的浓度，在感染后24 h内，能够引起小鼠死亡率超过70%的最小菌液浓度选为攻毒浓度。试验确定每只小鼠皮下注射浓度为103CFU/mL的细菌混悬液0.1 mL，阴性对照组每只小鼠皮下注射生理盐水0.1 mL。治疗试验：攻毒当天灌服药液，连续给药3 d，停药后观察10 d；预防试验：连续灌服药物3 d后皮下注射菌液，自攻毒之日起连续观察10 d。统计各组死亡小鼠的数量，按常规方法对病死小鼠进行剖检，分离组织和体液中的细菌进行革兰染色镜检，确定死亡原因。

1.10.3 防治效果评价 用保护率进行评价：

2 结果

2.1 单药对巴氏杆菌的抑菌效果 不同药物对巴氏杆菌的体外抑菌效果见表1、表2。由表1可知，香附和黄连对巴氏杆菌的抑菌效果最好，MIC均为25 mg/mL，香附的MBC为50 mg/mL，黄连的MBC为200 mg/mL。由表2可知，在供试的7种抗菌药中，恩诺沙星对巴氏杆菌的抑菌效果最强，MIC为0.5 μg/mL，MBC为1 μg/mL。硫酸新霉素和替米考星对巴氏杆菌的抑菌效果也较好，MIC分别为0.5 μg/mL和2 μg/mL。选取恩诺沙星和香附进行下一步试验。

表1 单味中药对巴氏杆菌的MIC和MBCTable 1 MIC and MBC of single Chinese medicine against Pasteurella (mg/mL)

表2 不同抗菌药对巴氏杆菌的MIC和MBCTable 2 MIC and MBC of different antibacterial agents against Pasteurella (μg/mL)

2.2 药物联合对巴氏杆菌的抑菌效果 选取抑菌效果最好的中药香附与抗菌药恩诺沙星进行联合，恩诺沙星和香附联用时，恩诺沙星用量为单独用药的1/2、香附用量为单独用药的1/16即能呈现抑菌效果，FIC指数=0.56，为累加作用，表明恩诺沙星和香附两药联用时为相加作用，抑菌效果增强。

2.3 不同药物对小鼠感染巴氏杆菌病的预防效果 选取香附和恩诺沙星及其联合进行防治试验。预防试验结果见表3，攻毒后阳性对照组小鼠死亡20只，存活率为0%。灌服药物组的小鼠死亡率与阳性对照组比较均降低；香附、恩诺沙星以及香附和恩诺沙星联合对小鼠的保护率分别为10%、60%、70%。香附与恩诺沙星联合组的保护率最高，对小鼠感染巴氏杆菌病的预防效果较好。

表3 不同药物对小鼠感染巴氏杆菌的预防效果Table 3 Preventive effects of different drugs on infection of Pasteurella in mice

2.4 不同药物的治疗效果 各种药物对小鼠感染巴氏杆菌病的治疗效果见表4，攻毒后阳性对照组小鼠死亡20只，保护率为0%。灌服药物组的小鼠死亡率与阳性对照组比较有所降低；香附、恩诺沙星以及香附与恩诺沙星联合对小鼠的保护率分别为25%、75%、80%。香附与恩诺沙星联合组的保护率最高，对感染巴氏杆菌病的小鼠有较好的治疗效果。

表4 不同药物对小鼠感染巴氏杆菌的治疗效果Table 4 Therapeutic effect of different drugs on infection of Pasteurella in mice

2.5 病死小鼠的剖检结果及细菌形态特征 剖检病死小鼠可见皮肤、黏膜发绀；心脏脂肪有出血点及灰色坏死病灶，心包积液；肝脏出血；脾脏出血；肾脏出现水肿，有出血、淤血。

分离组织和体液中细菌进行鉴定，染色镜检为革兰阴性、两极浓染的短杆状或球杆状细菌，符合巴氏杆菌的形态特征。

3 讨论

3.1 抗菌药物对巴氏杆菌的体外抑菌效果 巴氏杆菌对新霉素、替米考星和恩诺沙星敏感，MIC分别为0.5 μg/mL、2 μg/mL和0.5 μg/mL，其中恩诺沙星的抑菌效果最好。刘红玉等[8]通过检测鹅源巴氏杆菌对16种常用抗菌药的敏感性时发现，其对喹诺酮类抗生素高度敏感。胡泽兵[9]通过药敏试验发现分离的多杀性巴氏杆菌对恩诺沙星和新霉素高度敏感。张旭等[10]研究发现，替米考星对禽多杀性巴氏杆菌的MIC为2 μg/mL。中药以香附、黄连的抑菌效果(25 mg/mL)最强。黄楠等[11]发现，四黄止痢颗粒方剂的6种中药中黄连对多杀性巴氏杆菌的抗菌活性最强，MIC为1.563 mg/mL。香附具有镇痛解热、抗菌抗炎的功效。香附与恩诺沙星联合用药增强了抑菌效果。

3.2 药物联合对小鼠巴氏杆菌病的防治效果 本试验中采用香附、恩诺沙星、香附和恩诺沙星联用，治疗和预防小鼠巴氏杆菌病的作用与阳性对照组相比有所提高。恩诺沙星对小鼠感染巴氏杆菌病的防治效果较好，保护率分别为60%和75%。马驿等[12]研究发现，恩诺沙星对鸡巴氏杆菌病的治疗和预防效果较好，保护率分别为33.33%和70%。香附对小鼠巴氏杆菌病的防治效果不理想，保护率分别为10%和25%。香附和恩诺沙星联合对巴氏杆菌病的预防和治疗效果比单药强，保护率分别为70%和80%。说明香附与恩诺沙星联用在预防小鼠巴氏杆菌病中能够降低巴氏杆菌对恩诺沙星的耐药性，配合香附一起使用更充分发挥药物的作用。

3.3 药物联合在疾病防治中的作用 抗生素一直是治疗细菌性疾病的首选药物，但抗菌药具有毒副作用，易引发双重感染，随着抗菌药的大量使用，细菌易出现耐药性和药物残留，给人类健康造成威胁[13]。胡星星等[14]研究发现，分离的55株巴氏杆菌对临床常用抗菌药都产生了耐药性。而中药具有抗炎消炎，不易产生耐药性的特点，重在提高机体的免疫能力，平衡机体的各项功能，还能提高其对抗生素的敏感性[15]。高艳等[16]发现，翼草景香水煎液对多杀性巴氏杆菌具有良好的体内、外抑菌活性。中西药的联合使用在治疗和预防巴氏杆菌病方面得到认可。由黄连、黄芩等中药和氟苯尼考联合，对鸭禽霍乱的防治效果明显[17]。裴立峰[18]研究发现，中药复方结合双氟沙星、氧氟沙星等西药对禽霍乱的治愈率达91.5%。这充分体现了中西药结合的优势，但其抑菌成分和机理不明确，盲目的使用和滥用，仍会使细菌产生耐药性，降低疗效。因此需对其进行深入的研究，合理进行药物联合。