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次氯酸根荧光分子探针与人血清白蛋白相互作用的研究

2020-10-23曾晓丹马明硕

化工技术与开发 2020年10期
关键词:残基吸收光谱常数

曾晓丹,赵 影,马明硕,金 星

(吉林化工学院分析测试中心,吉林 吉林 132022)

萘酰亚胺属于具有大平面的芳香性杂环化合物,研究表明它可通过插入或沟槽结合,与双链DNA发生作用,从而影响到DNA 的复制,进而阻断细胞的分裂过程,因此具有良好的抗肿瘤活性,是医学中常被用来作为药物开发的一类物质[1]。1,8-萘酰亚胺的Stocks 位移较大,吸收和荧光峰型都比较宽,作为荧光基团用来进行结构调整相对比较简单[2],因此常作为荧光基团被各种荧光探针采用。

血清白蛋白是生物体内血浆中含量最丰富的蛋白质,参与了生物体内许多重要生理功能,比如维持血清的正常pH 值和血浆胶体渗压。同时血清白蛋白具有可与许多内源和外源性物质结合的特点,是物质在体内运输的重要载体[3]。因此,经常通过研究小分子物质与血清白蛋白的相互作用,来阐明物质在体内的运输及分布情况。

本课题组自主设计了用于识别生物体内ClO-的荧光探针 ZZY-19 (图1),并成功应用于细胞成像研究。为了进一步了解探针如何在体内运输与分布,从分子水平上解释与验证探针的识别机理,为探针良好的选择性识别提供更多的信息,以便为设计出更多灵敏度高、选择性好的探针,以及进行结构调整提供理论指导和技术支持,本文采用荧光光谱法测定了 ZZY-19 与 HSA 之间的结合常数、热力学参数等,通过同步荧光光谱和紫外光谱,研究两者结合前后HSA 构象的变化,进一步揭示ZZY-19 与HSA之间可能存在的相互作用,为最终阐明ZZY-19 的识别机理提供一系列分子相互作用的信息。

图1 探针ZZY-19 的化学结构式Fig.1 The moleuclar structure of ZZY-19

1 实验部分

1.1 实验试剂与仪器

HSA,配制成浓度为10-5mol·L-1储备液,探针ZZY-19 用三氯甲烷配成10-3mol·L-1储备液,Tris(10-2mol·L-1,pH=7.4)缓冲溶液。其他所有试剂均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水。

荧光分光光度计,UV-2550 紫外分光光度计,pH 计。

1.2 实验步骤

移取适量的探针ZZY-19 储备液、HSA 储备液、乙醇溶液,以 pH=7.40 的Tris-HCl 缓冲溶液定容至3mL。HSA 的浓度为2 μmol·L-1,探针的浓度范围为0~10 μmol·L-1,测定溶液的溶剂体系为乙醇∶水=1∶4(V/V)。将测定溶液摇匀静置。

荧光光谱的测定:激发波长为280nm,激发和发射狭缝为5nm,扫描加入探针前后290~450nm 范围内HSA 的荧光光谱。

紫外吸收光谱的测定:以 Tris-HCl 缓冲溶液为参比,扫描加入探针前后200~400nm 范围内HSA的紫外吸收光谱。

2 结果与讨论

2.1 HSA 与ZZY-19 的紫外吸收光谱

测定了 HSA 加入不同浓度的探针 ZZY-19 前后的HSA 的紫外吸收光谱(图2)。由图2 可以看出,随着探针 ZZY-19 浓度增加,HSA 在280nm 处的吸收强度随之增大并发生蓝移,表明HSA 与探针形成了复合物,改变了HSA 的微环境,不仅使HSA 的紫外吸收光谱发生了变化,也使HSA 的二级结构发生了变化[4]。

图2 探针ZZY-19 作用的HSA 紫外-可见吸收光谱Fig.2 The Uv-vis of HSA with the addtion of ZZY-19

2.2 HSA 与ZZY-19 的荧光光谱

HSA 内部的 Trp、Tyr 和 Phe 残基是HSA 主要的荧光来源,而Trp 残基则是形成其内源荧光的主要部分。由探针ZZY-19 对HSA 的影响(图3)可见,随着探针浓度增加,HSA 的荧光强度逐渐降低并伴随着最大发射峰的蓝移。实验结果表明,探针ZZY-19 与HSA 通过相互作用结合形成了复合物,这种结合改变了HSA 分子中氨基酸残基的微环境。荧光猝灭可分为静态猝灭和动态猝灭,两种猝灭机制的主要区别在于猝灭常数与温度的不同联系。静态猝灭常数往往随温度的升高而减小,而动态猝灭常数则随温度的升高而增大。

在3 种不同的温度条件下测定了HSA 的荧光数据,根据式(1)计算得到了Ksv 值和Kq 值(表1)。

图3 不同探针ZZY-19 浓度条件下 HSA 的荧光光谱Fig. 3 The Fluorescence spectra of HSA with the different concentration of ZZY-19

由表1 可知,Ksv 值和Kq 值与浓度的线性关系良好。随着温度升高,猝灭常数减小,且Kq 值远远大于最大扩散碰撞猝灭常数2.0×1010L·mol-1·s-1。由此可以推测,二者的猝灭机制来源于探针ZZY-19 与HSA 结合形成的静态复合物,而不是由动态猝灭机制引起的[5]。同时,HSA 的最大发射峰稍有蓝移,说明内部环境的极性逐渐降低,进一步证实了探针与HSA 之间存在相互作用[6]。

表1 不同温度时的 HSA 探针ZZY-19 体系的Ksv 和Kq 值Table 1 The valuea of Ksv and Kq between HSA and ZZY-19 at different temperatures

2.3 HSA 与ZZY-19 结合常数和结合位点的确定

根据静态淬灭机制,如果蛋白质中存在相似且独立的结合位点,则可根据公式(2) ,计算得到探针与HSA 的结合常数以及结合位点数[7]:

结合位点数n的值大约为1 (表2),表明每1 个HSA 分子能够结合1 个探针ZZY-19 分子。

表2 不同温度下的结合常数K 和结合位点数 nTable 2 The values of K and n between HSA and ZZY-19 at different temperatures

2.4 HSA 与ZZY-19 的热力学分析和结合力类型的确定

化合物和生物体内蛋白质分子间的结合力主要有4 种类型,即范德华力、氢键、静电引力和疏水作用力。对热力学参数进行分析,可以得到探针ZZY-19 与HSA 之间的作用力类型。若焓变(ΔH)的变化在所研究的温度范围内很小,则可将该反应的焓变视作一个常数。可以由公式(3)计算得到焓变值(ΔH)和熵变值(ΔS):

再由公式(4)计算得到结合反应的自由能变:

从计算得到的热力学函数值(表3)可以看出,ΔH>0,ΔS>0,表明探针ZZY-19 与HSA 的结合过程由疏水力占主导作用,另外由计算数据可知ΔG<0,说明二者之间的结合可自发进行[8]。

表3 ZZY-19 与HSA 结合的热力学参数Table 3 Thermodynamic parameters for the binding of ZZY and HSA

2.5 HSA 与ZZY-19 结合距离的确定

从Förster 的非放射共振能量转移理论,可以得到探针ZZY-19 与HSA 之间的结合距离。依据式(5)和式(6),可计算得到ZZY-19 与HSA 之间的能量转移效率E[9]:

其中,J是供体的发射光谱和受体的吸收光谱之间的光谱重叠积分。通过式(7)得出:

通过计算可求得如下参数:J=2.128×10-15cm3·L·mol-1,R0=1.97 nm,r=2.56 nm,可 见 探 针ZZY-9 与HSA 残基的作用距离r小于8nm,并且满足0.5R0<r<1.5R0的关系。计算结果表明,二者的结合符合Förster 能量转移理论提出的条件,HSA与探针ZZY-19 之间的结合,是非辐射能量转移,与静态淬灭机制的发生机理完全符合。

3 结论

本文在体外生理条件下,应用荧光光谱与紫外光谱,对探针ZZY-19 与HSA 的相互作用进行了研究。结果表明,疏水力在探针ZZY-19 与BSA 的结合中起主要作用,并且相互作用可以自发进行。在相互作用的过程中,探针ZZY-19 可以插入到HSA的疏水腔中。从HSA 到探针ZZY-19 可以发生非放射性能量转移,探针ZZY-19 与HSA 的结合距离约为2.56nm(298K)。本研究结果有助于了解探针ZZY-19 与HSA 的结合机制,更好地了解探针ZZY-19 对血液运输和分配过程中蛋白质功能的影响。这些信息有助于探针ZZY-19 的识别开发和应用。

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