王何柱 朱 勇 朱 怡 何友勋 秦礼康 梁亚丽

(贵州大学酿酒与食品工程学院1，贵阳 550025) (贵州省植保植检站2，贵阳 550001) (毕节市农业科学研究所3，毕节 551700)

芸豆(PhaseolusvulgarisL.)是豆科菜豆属一年生草本植物的籽粒，原产于南美洲，我国在16世纪末开始种植栽培，其豆荚和种子被广泛食用，尤其是在亚洲国家[1]。芸豆不仅含有人体必需氨基酸、蛋白质、维生素、膳食纤维等营养成分，而且也是酚类物质、黄酮等功能成分的重要来源[2，3]。很多研究表明人的机体衰老与自由基的产生密切相关，而酚类物质有较强的清除自由基的能力[4]。李思荻等[5]研究发现各种豆类的还原能力与总黄酮和总酚的含量呈正相关，并且这两种物质能有效的清除羟基自由基。巩蔼等[6]证实云南的8种豆类中酚类物质质量分数大于0.1%，并且类黄酮提取物对DPPH自由基的清除能力都大于69%。Madhujith[7]研究结果表明，有色种皮豆类显示出较好的自由基清除能力。赵艳等[8]研究小扁豆、红芸豆、鹰嘴豆等杂豆时，发现他们的总酚黄酮含量丰富。目前，国内对杂豆和芸豆的抗氧化活性已有一定的研究，但对不同颜色芸豆中的酚类化合物组成和抗氧化活性的差异研究较少。本实验以7种不同花色芸豆为原料，研究其酚类化合物组成及抗氧化活性，为芸豆深加工提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

毕芸Ⅱ1、英国红、龙12-2614、科芸1号、天镇黄芸豆、毕芸2015-1、毕芸2号7种芸豆的颜色分别为黑、红、白、白花、黄、红花、黑红色。7种芸豆的产地为贵州省毕节市，由贵州省毕节市农科所提供。用粉碎机将芸豆粉碎后，全部通过30目钢筛并存储在-20 ℃保存。

6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸、2,2-二(4-叔辛基苯基)-1-苦肼基自由基、福林酚、芦丁、2,2’-联氮双-(3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸)二胺盐、2,4,6-三(2-吡啶基)-1,3,5-三嗪均为分析纯；3,4,二羟基苯甲酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸为色谱纯。

1.2 仪器与设备

RE-2000B型旋转蒸发仪，H2-16KR型台式高速冷冻离心机，L5S紫外可见分光光度计，TS-100C恒温摇床，SpectraMax190 光吸收酶标仪，1260 Infinity高效液相色谱仪。

1.3 实验方法

1.3.1 酚类提取物的制备

参考Adom等[9]的方法并略作修改，将1 g的样品与20 mL的冷冻丙酮(80%)混合后，放在振荡器震荡10 min，然后在8 500 r/min下离心10 min。收集上清液并重复提取两次，将收集的上清液倒入烧瓶中并在45 ℃的旋转蒸发器中旋蒸至10 mL左右，然后用蒸馏水定容到25 mL，得到游离态酚类物质。

1.3.2 总酚含量测定

参考Singleton 等[10]的方法并稍加改进。采用Folin-Ciocalteu比色法测定总酚含量，准确移取100 μL的提取液和没食子酸标准溶液至试管中，之后加入400 μL蒸馏水和100 μL的福林酚试剂，混匀静置6 min后加入1 mL 7%的碳酸钠溶液和0.8 mL的蒸馏水，避光反应2 h后，以蒸馏水代替样品做空白，在760 nm波长处用酶标仪测定吸光度，结果以每克干基中所含没食子酸当量(GAE)的质量表示(mg GAE/g DW)。

1.3.3 总黄酮含量测定

参照Bakar等[11]的方法进行。准确吸取0.5 mL的提取液或芦丁标准溶液，分别加入2.25 mL的蒸馏水和0.15 mL 5%的亚硝酸钠溶液，反应6 min后加入0.3 mL 10%的氯化铝溶液，震荡混匀静置5 min，加入1 mL 1mol/L的氢氧化钠溶液，摇匀后在510 nm波长处测定吸光度。以蒸馏水替代提取液作对照。每个处理重复3次，结果以每克干基中所含芦丁当量(RE)的毫克数表示(mg RE/g DW)。

1.3.4 酚类化合物组成分析

参考Irmak和Ti等[12，13]的方法，吸取提取物1 mL并过0.45 um的滤膜，各样品的分析采用Agilent Technologies 1260 infinity 系统，ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 um)。HPLC的总运行时间为50 min，梯度洗脱的程序如下：0～5 min，5%～15% A；5～35 min，15%～35% A；35～40 min，35%～45% A；40～50 min，45%～5% A。检测器为紫外吸收检测器(UVD)，检测波长为280 nm，柱温30℃，流动相A为乙腈，流动相B为1%的冰乙酸溶液，流速为1.0 mL/min，进样量20 μL。

1.3.5 抗氧化活性测定1.3.5.1 DPPH自由基清除能力测定

参考Pawel[14]等的方法，分别吸取0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3 mL 0.1 mg/mL 的Trolox标准溶液于容量瓶中，然后加入4 mL 0.1 mmol/L 的DPPH溶液，加无水乙醇定容至5 mL。混匀静置30 min，用紫外分光光度计在517 nm波长处测定吸光度值并绘制标准曲线。吸取0.1 mL的提取液，加入4 mL 0.1 mmol/L 的DPPH溶液，用无水乙醇定容至5 mL。混匀静置30 min，用紫外分光光度计在517 nm波长处测定吸光度值。以蒸馏水代替样品做空白，DPPH自由基清除能力以mg Trolox标准物质/g豆类干物质表示(mg TE/g DW)。

1.3.5.2 ABTS+自由基清除能力测定

参考Arnao等[15]的方法。首先配制7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L过硫酸钾溶液并将两者等体积混合，在室温黑暗条件下反应12 h得到母液。吸取1 mLABTS母液，加入22 mL甲醇进行稀释，使吸光度达到(1.1±0.02)。准确吸取150 μL稀释8倍的提取液和Trolox标准溶液，加入2 850 μL的ABTS溶液，在黑暗条件下反应2 h，用紫外分光光度计在734 nm波长处测定吸光度值。以蒸馏水代替样品做空白，结果以每克干基中所含Trolox当量(TE)的微摩尔数表示(μmol TE/g DW)。

1.3.5.3 铁离子还原抗氧化能力(FRAP)测定

参考Benzie等[16]的方法。取150 μL稀释9倍的提取液或Trolox标准溶液与2 850 μL的FRAP溶液(300 mmol/L醋酸钠缓冲溶液∶20 mmol/L FeCl3∶10 mmol/LTPTZ=10∶1∶1混匀，在37 ℃反应10 min，用酶标仪在593 nm波长处测定吸光度值。以蒸馏水代替样品做空白，结果结果以每克干基中所含Trolox当量(TE)的微摩尔数表示(μmol TE/g DW)。

1.4 数据分析

每组实验均重复3 次，通过Excel统计数据，采用Origin9.0进行绘图，并使用SPSS 16.0软件分析数据，采用Duncan多重检验法进行显著性分析(P<0.05)。

2 结果分析

2.1 7种芸豆的总酚和总黄酮含量

从表1中可以得出7种芸豆的总酚含量在0.91～4.96 mg GAE/g DW，其中黑色芸豆的总酚含量最高，白色芸豆的最低。赵艳等[8]研究小扁豆、红芸豆、鹰嘴豆等杂豆时，得出3种芸豆的总酚含量为9.05～13.48 mg GAE/g，明显大于本研究结果，可能是原料和产地的不同导致。从表1中可以看出黑色芸豆的总酚含量大概为白色芸豆的5倍，深色芸豆的酚类含量要明显高于浅色芸豆，Xu等[17]通过对9种豆类的抗氧化活性研究，同样也得出黑色豆皮芸豆的酚类物质含量比其他颜色豆类的要高，这与本实验结论一致。Xu等[18]在研究中得出红小豆和红芸豆的含量分别为12.5、6.85 mg/g，高于实验中英国红的总酚含量(3.96 mg GAE/g)。Amarowicz等[17]的研究中红小豆、蚕豆、扁豆的总酚含量要高于本实验。

由表1看出，红花色芸豆的总黄酮最高，其次分别为白花色、红色、黑色、黄色、黑红色、白色芸豆的含量最低。李思荻等[5]在研究几种黑龙江种植豆类中，以儿茶素做为标准品测得黑豆、红小豆、芸豆、白芸豆的黄酮含量分别为0.295 1～2.152 8、0.069 4～1.475 7、0.086 8～1.909 7、0.191 0～0.625 0 mg/g。梁亚静等[19]在研究黑芸豆、奶花芸豆、紫花芸豆时，测得其黄酮含量范围为2.4～8.89 mg RE/g DW，在本实验结果范围内。赵艳等[8]研究小扁豆、红芸豆、鹰嘴豆等杂豆时，三种芸豆的总黄酮含量为7.78～17.55 mg/g，与本实验的结果有一点差异，可能是品种的不同导致。Kan等[20]研究中发现白芸豆中总黄酮含量范围为0.78～1.33 mg RE/g DW，红芸豆总黄酮含量范围为4.05～5.19 mg RE/g DW，红色芸豆的黄酮含量远高于白色芸豆，本实验中英国红(红色)的黄酮含量也远远高于龙12～2614(白色)，这与本研究结论保持一致。

2.2 7种芸豆酚类化合物的组成

表2结果表明，绿原酸、3,4,二羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸是芸豆中的主要酚类物质，其中3,4,二羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸的最高含量都出现在毕芸Ⅱ1(黑)中，在龙12-2614(白色)芸豆中只检测出咖啡酸和3,4,二羟基苯甲酸，并且咖啡酸的含量是7种芸豆里面最低的，从中我们可以得出深颜色芸豆中含有较丰富的酚类物质。Xu等[21]在对黑豆种皮中游离态多酚的组成分析中检测出原儿茶酸，2，3，4-三羟基苯甲酸和香草酸)六种肉桂型酚酸(咖啡酸，绿原酸，m-香豆素、阿魏酸、O—香豆素和反式肉桂酸)其中咖啡酸，绿原酸，反式肉桂酸是种皮中的主要酚酸。造成这种差异的原因可能是品种、农艺措施(灌溉、施肥、病虫害管理)、成熟度收获、收获后储存和气候条件不同的影响[22]。Luthria等[23]在研究十五种干食用豆中酚酸含量中得出阿魏酸是所有大豆品种中的主要酚酸，并且得出每100 g干豆样品中阿魏酸的平均含量为17.8 mg/100 g，在本实验中阿魏酸只在毕芸Ⅱ1(黑)和英国红(红)两种芸豆中检测出来，并且含量远远低于他的结果，这种情况可能是品种的不同的原因。

2.3 7种芸豆提取物对DPPH自由基清除能力的影响

从图1中可以得出毕芸2015-1(红花色)对DPPH自由基清除能力最强，7种芸豆对DPPH自由基的清除能力的范围是0～7.38 mg TE/g DW。龙12-2614在实验中发现其对DPPH自由基的清除能力为0，也就是说明白色的芸豆没有清除能力。Gujral等[24]在研究6种豆类的抗氧化活性中，发现芸豆具有最高的DPPH自由基率(38.1%)。Xu等[17]研究中发现深色种皮的豆类的DPPH自由基清除能力最强，其中黑大豆的对DPPH自由基的清除率最高，这与本实验结果有一定的差异，虽然本实验中毕芸2015-1(红花色)芸豆的DPPH的自由基清除能力最强，但黑芸豆的DPPH清除能力较其他芸豆也较高(5.38 mg TE/g DW)。由表1和图1可以看出，总酚和总黄酮的含量与DPPH自由基清除能力并不完全相关，这与田金河[25]报道的豆类样品中总黄酮和总酚含量高并不一定对 DPPH·具有高的清除率一致，还说明黄酮类化合物是一类结构相似但种类繁多的化合物，对于清除各个自由基的作用机制各不相同，所以对不同自由基的清除有一定的选择性。

表1 芸豆提取物总酚和总黄酮的含量

图1 芸豆提取物对DPPH自由基清除的影响

表2 7种芸豆酚类物质的组成和含量(μg/g DW)

2.4 7种芸豆提取物对ABTS+自由基清除能力的影响

图2中显示，黑芸豆的ABTS+自由基清除能力最强，其次分别为红花色、白花色、黑红色、黄色、红色、白色芸豆，7种芸豆的ABTS+自由基清除能力的范围是1.42～17.53 μmol TE/g DW。梁亚静等[19]在研究黑芸豆、奶花芸豆、紫花芸豆中多酚、黄酮含量及抗氧活性时得出紫花芸豆的ABTS+清除能力为88.47 μmol TE/g DW，她的实验结果要明显大于本实验。Hwa等[26]研究得出几种豆类的ABTS+自由基清除能力的范围是1.1～5.61 μmol TE/g，本实验结果高于该范围。从表1和图2可以看出总酚含量较高的毕芸Ⅱ1(黑)和毕芸2015-1(红花)两种芸豆，他们对ABTS+自由基清除能力也较强。

图2 芸豆提取物对ABTS+自由基清除的影响

2.5 7种芸豆提取物对铁离子还原抗氧化能力(FRAP)的影响

从图3中可以看出黑色芸豆和红花色芸豆的铁离子还原抗氧化能力要强于其他颜色芸豆，其中白色芸豆的抗氧化能力最弱，7种不同颜色芸豆的铁离子还原抗氧化能力的范围是0.95～9.26 μmol TE/g DW。Xu等[17]研究得出一些豆类的FRAP值，其中黑豆的为1.27～9.93 mmolFe/100 g；黄色大豆为0.13～0.34 mmol Fe/100 g，红芸豆为2.85～9.22 mmolFe/100 g，可以看出黑豆的FRAP值明显大于黄豆，说明了深颜色芸豆，其抗氧化活性要强，在本实验中毕芸Ⅱ1的铁离子抗氧化能力也明显强于天镇黄芸豆，这与本实验的结论保持一致。梁亚静等[19]在研究中发现奶花与紫花芸豆的FRAP值分别为34.48和42.95 μmol TE/g DW，本实验的结果明显低于梁亚静的实验结果，可能是由于原料和产地的不同导致。赵艳[8]在研究几种杂豆的抗氧化活性时，以硫酸亚铁为标准品测得几种芸豆的FRAP值得范围为461.33～1 008.29 μmol/g，实验中芸豆的FRAP值要明显强于鹰嘴豆。

图3 芸豆提取物对铁离子还原抗氧化能力的影响

2.6 芸豆种皮提取物中酚类物质、黄酮含量与抗氧化能力的相关性分析

从表3可以看出总酚的含量与3个抗氧化值极显著相关(P<0.01)，且其相关性大于总黄酮的含量与3个抗氧化值的相关性。Xu等[21]在研究萃取溶剂对豆科植物酚类物质及抗氧化活性影响中发现，当提取溶剂为80%的丙酮时总酚含量与DPPH、FRAP、ORAC之间极显著相关，并且其相关性要大于黄酮含量与DPPH、FRAP、ORAC的相关性，这与本结果保持一致。梁亚静等[19]在研究萌发对芸豆酚类物质及抗氧化活性的影响中得出多酚、黄酮含量与四个抗氧化值(DPPH、ABTS、FRAP、ORAC)极显著相关，且DPPH与FRAP的相关性最高(r=0.954)，而本研究中DPPH与FRAP的相关性最好(r=0.990)，这可能是提取方式的不同造成的。

表3 芸豆中总酚、总黄酮及抗氧化值的相关性

3 结论

研究了7种不同花色芸豆酚类物质的含量以及抗氧化活性，对酚类物质的组成进行分析，并对多酚和黄酮的含量和抗氧化能力做了相关性分析。结果表明，7种芸豆的总酚含量范围为0.91～4.96mg GAE/g DW，黄酮的含量范围为3.29～12.87 mg RE/g DW，其中黑色芸豆的总酚含量最高。绿原酸、3,4,二羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸是芸豆中的主要酚类物质，其中3,4,二羟基苯甲酸和、对羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸的最高含量都出现在黑色的毕芸Ⅱ1中，可以说明深颜色芸豆中含有较丰富的酚类物质；DPPH、ABTS、FRAP三种不同的抗氧化方法结果显示黑色的毕芸Ⅱ1和红花色的毕芸2015-1抗氧化能力较强，白色的龙12-2614抗氧化能力最弱。这为开发多样化芸豆产品提供了参考，在生产功能性食品时，可以倾向于颜色较深的芸豆作为原料。