徐凤华 孙晓鸣

南京医科大学附属苏州科技城医院药学部，江苏苏州 215153

癫痫是一种慢性疾病，主要是大脑神经元突发性异常放电导致短暂大脑功能障碍[1]。抗癫痫药加巴喷丁（gabapentin，GBP）是γ-氨基丁酸（GABA）的类似物，结构具有多晶型。加巴喷丁可以增加癫痫患者脑中GABA的水平，可抑制癫痫发作。与其他抗癫痫药相比，加巴喷丁副作用较小，几乎没有药物相互作用，能够降低带状疱疹引起的疼痛[2-3]。加巴喷丁的药动学特征存在个体差异，中毒症状与疾病症状不易区分[4]，因此监测加巴喷丁血药浓度对保证患者临床用药安全具有重要意义。血浆中加巴喷丁浓度的测定方法主要包括LC-UV法[5-6]、LC-FD[7-10]和LC-MS/MS[11-16]。本研究在文献报道的基础上，建立简便、快捷的LC-MS/MS法测定人血浆中加巴喷丁的浓度。血浆前处理为甲醇沉淀血浆蛋白，定量下限为20.00ng/mL，低于文献报道[5-15]，为人血浆中加巴喷丁浓度检测提供手段。

1 仪器与材料

1.1 仪器设备

液相质谱联用仪：三重四极杆串联质谱仪（型号：API4000，美国AB Sciex公司）；高效液相色谱仪（型号1260，美国Agilent公司）；操作软件工作站为Analyst（版本号为1.6）。天平：（型号XS 105DU，瑞士梅特勒-托利多METTLER TOLEDO公司）。

1.2 对照品与试剂

加巴喷丁对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100655-201302，含量：99.8%）；左乙拉西坦对照品（北京博时安泰科技发展有限公司，批号：20150401，含量：99.94%）；乙酸铵（AR级，国药集团化学试剂有限公司）。甲醇、乙腈和甲酸（HPLC级，TEDIA公司）；水（安徽双鹤药业有限责任公司）。

2 方法

2.1 色谱条件及质谱参数

色谱条件：预柱选用Phenomenex公司Security GuardTMC18柱，规 格 为4.0mm×3.0mm；采 用WATERS公司Symmetry®系列C18色谱柱，规格为3.9×150.0mm，粒径5μm；流动相：水相为5mmoL/L醋酸铵水溶液（含0.3%甲酸）；有机相选用乙腈，有机相∶水相=10∶90（v/v），流速为1000μL/min；每个样品运行时间为6.0min，使用切换阀系统，A（排废）和B（质谱系统）两个通道，样品在0.0～2.0min进入通道A，在2.0～6.0min进入通道B；进样量设定为10μL；柱温设定为30℃。

质谱参数：选用APCI大气压力化学电离源，监测模式：正离子电离模式，采用MRM多反应监测；巴喷丁母离子m/z为172.1，子离子m/z为154.1；内标左乙拉西坦母离子m/z为171.1，子离子m/z为126.1，去簇电压（declustering potential，DP）参数分别为30V和45V，碰撞能（collision energy，CE）参数均为22V，扫描时间为200ms。离子源参数：温度（TEM）为400℃，雾化气（N2）为50psi；放电电流为2μA。

2.2 工作液配制

加巴喷丁标准曲线系列贮备液及工作液：使用10mL容量瓶，称量加巴喷丁对照品10.02mg（含量折算后为10.00mg加巴喷丁），用有机溶剂甲醇溶解、稀释并定容，混匀后，溶液为1.000mg/mL的加巴喷丁标准曲线系列贮备液，用有机溶剂甲醇逐步稀释，配制加巴喷丁标准曲线系列工作液，加巴喷丁浓度依次为0.4000、1.000、2.000、6.000、20.00、40.00、80.00和160.0μg/mL。

加巴喷丁质控系列贮备液和工作液：使用10mL容量瓶，称量加巴喷丁对照品10.02mg（含量折算后为10.00mg加巴喷丁），用有机溶剂甲醇溶解、稀释并定容，混匀后，溶液为1.000mg/mL的加巴喷丁质控贮备液，用甲醇逐步稀释，配制质控系列工作液，浓度依次为0.8000、12.00、120μg/mL。同时用甲醇稀释加巴喷丁定量下限工作液，浓度为0.4000μg/mL。

内标（左乙拉西坦）贮备液和工作液：使用10mL容量瓶，称取10.01mg左乙拉西坦对照品（含量折算后为10.00mg左乙拉西坦），用有机溶剂甲醇溶解、稀释并定容，混匀后，溶液为1.000mg/mL的内标（左乙拉西坦）贮备液。以内标（左乙拉西坦）贮备液为源溶液，用有机溶剂甲醇作为稀释溶液，配制12.00μg/mL的内标左乙拉西坦工作液。

2.3 血样样品前处理

于1.5mL规格离心管中，定量吸取200μL血浆样品，加入加巴喷丁标准曲线系列或质控系列工作液10μL和50μL内标（左乙拉西坦）工作液，加入600μL有机溶剂甲醇，用于沉淀血浆种蛋白，涡旋混匀约1min，置于低温高速离心机种，23755×g离心10min（设置温度为4℃）。离心后，定量吸取200μL上清液置进样瓶中，加入水相800μL，涡旋混匀后，置于高效液相色谱仪自动进样器模块（控温，设置温度为10℃）中，液质联用法进样测定加巴喷丁浓度。

3 结果

3.1 特异性实验

分别取加巴喷丁对照品溶液样品、内标（左乙拉西坦）对照品溶液样品、空白血浆按“2.3 血样样品前处理”方法处理后的样品；空白血浆200μL和加巴喷丁对照品溶液（6.000μg/mL）10μL混匀后按“2.3 血样样品前处理”项方法操作后的样品；分别进样测定。结果如下：加巴喷丁和内标（左乙拉西坦）的色谱保留时间分别约为2.50min和3.21min左右，血浆样品中内源性物质不干扰加巴喷丁和内标（左乙拉西坦）色谱峰，不影响加巴喷丁浓度的测定，见图1。

图1 血浆中加巴喷丁的LC-MS/MS图

3.2 标准曲线与最低定量限

定量吸取空白血浆200μL，依次分别加入加巴喷丁标准曲线系列工作液10μL，制备加巴喷丁血浆标准曲线系列样品，各血浆样品中加巴喷丁浓度分别为20.00、50.00、100.0、300.0、1000、2000、4000、8000ng/mL，按“2.3”项方法操作，进样测定，横坐标为加巴喷丁浓度c，纵坐标为血浆中待测物加巴喷丁峰面积As与内标（左乙拉西坦）峰面积Ai比值f，进行线性回归（权重系数为1/C2）。结果显示：血浆中加巴喷丁在浓度20.00～8000ng/mL浓度范围内，线性关系较好，最低定量限LLOQ为20.00ng/mL。

3.3 精密度和准确度

定量吸取200μL空白血浆，分别加入加巴喷丁3种不同浓度的质控系列工作液10μL，工作液浓度依次为0.4000、0.8000、12.00、120.0μg/mL，制备血浆质控系列样品，加巴喷丁浓度分别为20.00、40.00、600.0、6000ng/mL，每个浓度制备6个样品，按“2.3”项方法操作，测定3批，每个分析批需要随行标准曲线，根据标准曲线方程，计算浓度，同时统计批内、批间精密度和相对偏差（进行单因素方差分析），结果如下：低、中、高3种浓度血浆质控样品实测值与理论值偏差（RE）均在±15%范围内，批间和批内相对标准偏差（RSD，relative standard deviation）均小于15%。最低定量限（LLOQ）批内和批间RSD均小于20%，实测值与理论值偏差（RE）均在±20%范围内。

3.4 提取回收率

配制血浆样品，含加巴喷丁浓度依次为40.00、600.0、6000ng/mL，配制方法同“3.3 精密度和准确度”项，同一种浓度6个样品，按“2.3”项方法处理，进样检测得到加巴喷丁和内标左乙拉西坦峰面积。同时，配制空白血浆样品，使用有机溶剂甲醇沉淀蛋白后，直接加入低、中、高3种浓度加巴喷丁质控系列工作液10μL及50μL内标（左乙拉西坦）工作液，混匀，吸取200μL与水相800μL混匀后，测定得到加巴喷丁和内标左乙拉西坦峰面积。计算以上两种处理方式得到的加巴喷丁峰面积比值和内标（左乙拉西坦）峰面积峰面积比值。分别计算血浆中不同浓度加巴喷丁的提取回收率和内标（左乙拉西坦）的提取回收率。结果显示：血浆中加巴喷丁低、中、高三个浓度的提取回收率分别为（102.3±4.4）%（n=6）、（97.5±2.6）%（n=6）和（99.7±2.0）%（n=6）；内标左乙拉西坦的提取回收率为（98.7±3.0）%（n=18）。

3.5 基质效应

血浆样品基质：选择来源不同的6个空白血浆样品，各定量吸取200μL至离心管（规格1.5mL）中，加入有机溶剂甲醇600μL，涡旋1min，4℃下，23755×g离心10min，取上清液作为血浆基质，体积为700μL。

对照样品基质：定量吸取200μL纯化水至离心管（规格1.5mL）中，操作方法与制备血浆样品基质相同，得到对照样品基质。

分别定量吸取700μL血浆样品基质或对照样品基质，加入10μL加巴喷丁质控系列工作液和50μL内标左乙拉西坦工作液，混匀。定量吸取上述溶液200μL与800μL水相混匀。上述同一浓度样品平行制备和处理6份（低、中、高3个浓度），并按“2.1 色谱条件及质谱参数”项测定，获加巴喷丁和内标（左乙拉西坦）峰面积。计算同一浓度样品，两种基质（血浆样品基质或对照样品基质）中的峰面积比值。根据比值，计算基质效应。结果显示：血浆中加巴喷丁低、中、高三个浓度的基质效应结果分别为（103.5±4.1）%（n=6）、（97.4±3.6）%（n=6）和（96.7±2.7）%（n=6）；内标左乙拉西坦的基质效应为（96.9±4.8）%（n=18）。

3.6 稳定性实验

本研究考察了不同保存条件下，加巴喷丁血浆和贮备液样品的稳定性，结果如下：加巴喷丁血浆样品置于室温（25℃左右）放置6h、置于-30℃冰箱放置40d和-30℃反复冻融（取出融化，再放回-30℃冰箱）3种情况下，血浆样品中加巴喷丁浓度未发生显著变化，即加巴喷丁血浆样品仍稳定。待测样品置于高效液相色谱仪自动进样器模块中48h（控温，设置温度为10℃），加巴喷丁血浆样品经蛋白沉淀离心后，上清液置于室温（25℃左右）放置36h，加巴喷丁血浆次级样品仍稳定。加巴喷丁和内标（左乙拉西坦）贮备液置于室温（25℃左右）下放置12h和置于冷藏（2～8℃）中保存40d情况下，加巴喷丁和内标（左乙拉西坦）贮备液均稳定。

4 讨论

本研究优化了色谱和质谱参数，熊志立等[14]使用0.2%甲酸水溶液作为水相，流动相为甲醇∶0.2%甲酸水溶液（80∶20，v/v），本研究方法建立阶段，借鉴使用此流动相色谱条件，实验结果加巴喷丁色谱峰拖尾，这与文献[11]中提供的图谱相符。醋酸铵有利于改善加巴喷丁和内标左乙拉西坦峰形，相关文献[10，12]亦在流动相中加入了铵盐。液质联用仪常用的电离源为电喷雾离子源（ESI），本研究使用大气压力化学离子源（APCI）。方法建立阶段，本研究比较了使用APCI和ESI两种离子源的各自加巴喷丁离子强度，结果显示：用APCI离子源，加巴喷丁离子强度较大，本研究测定方法定量下限为20.00ng/mL，低于文献报道[5-15]。

本研究采用甲醇沉淀血浆中蛋白，沉淀离心后，定量吸取200μL上清液与800μL水相混匀，提高进样分析样品中水相的比例接近流动相中水的比例，防止二次化学平衡现象发生，可以使加巴喷丁色谱峰形减少拖尾。许萌等[16]在离心步骤后取上清液，经滤膜滤过后直接进样，本研究取上清液200μL，并加入到水相800μL中，混匀后进样，样品中血浆生物基质减少，可以降低基质效应和减少液质联用仪、色谱柱被污染的可能。

该液质联用方法测定血浆中加巴喷丁浓度，每个样品运行时间短，特异性高，甲醇直接沉淀蛋白，操作快捷，发挥了LC-MS/MS法的快速定量优势，可以满足大批量血浆样品检测的需要。