王聪聪，余慧，王彩霞，刘金平，綦战文，高雪峰，赵春芳※

（1.吉林大学药学院，吉林 长春 130021；2.吉林省延边韩工坊健康制品有限公司，吉林 延吉 133000；3.吉林省天亿福健康产业集团有限公司，吉林 长春 130000）

痛风是尿酸盐晶体在组织器官内沉积所导致的关节病，与机体内嘌呤代谢紊乱或体内尿酸排泄降低直接相关。临床主要表现为关节变形、痛风性关节炎[1-2]。其发病受遗传、地理环境和饮食习惯等多种因素影响，各年龄段均有发病可能，但多发于中年男性[3]。目前，临床常用化药及中药复方2 种方法治疗痛风。相比于毒副作用较大的化药治疗[4]，中药治疗因其多成分、多靶点且毒副作用较小，逐渐被广泛应用于痛风的临床治疗[5]。网络药理学基于系统生物学理论和生物网络平衡理论，从“多成分-多靶点-复杂疾病”的整体模式出发，在分子水平上阐述药物疗效及作用机制[6]。其整体性和系统性的特点与中药多成分及多靶点复杂的体系相契合[7-8]。

红参祛痹饮液是根据中医经验方，由红参、葛根、荷叶等11 味药食同源中药材及苦荞、玉米须、海洋鱼低聚肽粉制备而成的产品。其中红参补气固脱；蒲公英、马齿苋、淡竹叶和苦荞清热解毒；茯苓渗湿健脾；桑叶疏散风热；百合清心安神；栀子清热利湿；葛根通经活络；菊苣和玉米须利尿消肿；荷叶升发清阳；海洋鱼低聚肽促进钙的吸收，使钙质与骨细胞紧密结合，增加骨强度，可预防关节痛、关节炎和骨质疏松症等慢性骨科病[9-10]。近年来，在抗痛风的研究报道中，红参祛痹饮液中除了海洋鱼低聚肽粉外，红参[11]、蒲公英[12]、茯苓[13]、马齿苋[14]、淡竹叶[15]、桑叶[16]、百合[17-18]、栀子[19-20]、葛根[21-22]、菊苣[23-24]、荷叶[25]、玉米须[26-27]和苦荞[28]均具有一定的抗痛风活性，但尚未发现作用靶点及复方作用机制的相关研究报道。基于以上研究，本文构建了红参祛痹饮液“化学成分-痛风-靶点网络”的网络，以预测该饮液抗痛风的关键靶点及信号通路，为阐明该保健食品预防和治疗痛风性关节炎的作用机制提供思路和依据。

1 方法

1.1 红参祛痹饮液有效成分及靶点的预测

利用TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）数据库对红参祛痹饮液所含有效成分进行预测和筛选，筛选条件是口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30% 及类药性（drug likeness，DL）≥ 0.18，并结合相关文献对有效成分进行补充。将所得有效成分上传至PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库，对其命名规范化，并除去结构相同但不规范的重复命名的成分数据。

通过 Swiss Target Prediction（http://swisstargetprediction.ch/）、SymMap（https://www.symmap.org/）以及ETCM（http://www.tcmip.cn/ETCM/）等数据库结合文献查阅，对有效成分的靶点进行预测，去除重复值并淘汰打分较低的靶点。

通过Cytoscape3.7.2[6]软件构建“药物-有效成分-靶点”网络，对红参祛痹饮液的有效成分及对应靶点进行可视化分析。

1.2 痛风靶点的预测

利用DisGeNET（https://www.disgenet.org/）、Genecards（https://www.genecards.org/）等数据库预测得到痛风靶点，结合文献淘汰假阳性数据。

1.3 核心靶点的获取

将红参祛痹饮液有效成分靶点与痛风靶点相映射，绘制韦恩图。

1.4 “药物-有效成分-痛风-核心靶点”网络的构建

通过Cytoscape3.7.2[6]软件构建“药物-有效成分-核心靶点”网络，对红参祛痹饮液的有效成分及对应靶点进行可视化分析，同时经过拓扑属性分析进行筛选得到了关键靶点。

1.5 PPI网络的构建

将所得到的核心靶点上传至String（http://stringdb.org/cgi/input.pl）数据库，并设置相关参数，隐藏了离散节点（highest confidence=0.9），即为蛋白质-蛋白质相互作用的（protein-protein interaction，PPI）网络图。

1.6 GO生物过程富集分析及KEGG信号通路分析

首先，将所得核心靶点上传至DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）数据库进行 GO 和 KEGG 分析，下载数据文件，结合文献筛选出和痛风相关通路；其次，将通路数据导入Omicshare（https://auth.lifemapsc.com/）网站，将通路进行可视化分析，生成KEGG气泡图；最后，将核心靶点的基因symbol IDs 导入g：Profile（rhttps://biit.cs.ut.ee/gprofiler/convert）数据库转化为ensemble IDs，然后上传到Omicshare 网站进行GO 的可视化处理，得到GO 分析直方图。

2 结果与分析

2.1 红参祛痹饮液及痛风靶点的预测结果

共获取148 个红参祛痹饮液的有效成分，主要包括人参皂苷类、甾烷类和黄酮类等；据文献报道，多种有效成分与痛风治疗密切相关，其中红参有效成分的靶点映射到痛风的治疗靶点数目较多，说明红参作为传统中药，在红参祛痹饮液抗痛风作用中发挥核心作用。

共获取989 个有效成分的靶点，可视化分析结果见图1，中间蓝色方块为靶点，左上角紫色圆形为红参成分，浅粉色圆形为桑叶成分，橘色圆形为栀子成分，青色圆形为百合成分，浅粉色圆形为葛根成分，绿色圆形为菊苣成分，浅青色圆形为淡竹叶成分，红色圆形为荷叶成分，黄色圆形为蒲公英成分，粉色圆形为茯苓成分，深蓝色为玉米须成分，灰色为共有成分，深紫色为中药材名称。该网络包含1 137 节点，5 785 条边，其中山柰酚度（degree）值最大为182，其次是木犀草素度值为171，推测山柰酚和木犀草素在红参祛痹饮液抗痛风中发挥重要药理作用，说明红参祛痹饮液中多种中药材发挥着作用。

图1 “药物-有效成分-靶点”网络Fig. 1 “Drug-active ingredients-targets”network

2.2 痛风靶点的预测结果

基于DisGeNET 和Genecards 数据库我们收集到了184 个和1 031 个关于痛风的相关靶点，经过合并并删除重复靶点，共筛选得到1 015 个痛风靶点。痛风靶点如图2 所示，红色菱形为183 个核心靶点，视为筛选得到靶点，蓝色方块为832 个痛风相关预靶点。

2.3 核心靶点筛选结果

将药物有效成分靶点与疾病靶点取交集，得到183个药物-疾病交集靶点，并以此作为后续研究的核心靶点，韦恩图，见图3。

图3 活性成分靶点和痛风相关靶点的韦恩图Fig.3 Venn diagram of active component targets and gout-related targets

2.4 “药物-组分-有效成分-痛风-核心靶点”网络的构建

通过Cytoscape 3.7.2 软件构建“药物-组分-有效成分-痛风-核心靶点”网络，见图4，蓝色方块为核心靶点，深绿色最左侧为痛风，紫色菱形为中药材，浅青色圆形为百合成分，浅绿色圆形为菊苣成分，深蓝色圆形为玉米须成分，绿色圆形为蒲公英成分，黄色圆形为栀子成分，橘色圆形为荷叶成分，浅蓝色圆形为淡竹叶成分，浅粉色圆形为桑叶成分，红色圆形为茯苓成分，粉色圆形为葛根成分，紫色圆形为红参成分，最浅蓝色圆形为中药共有成分。网络包含327 个节点，1 761 条边。其中红参祛痹饮液所含组分的共有有效成分有17 种，分别为槲皮素、甘露醇、木犀草素、山柰酚、异鼠李素、异槲皮素、异甜菜素、芒柄花黄素、环阿屯醇、绿原酸、-谷甾醇、-胡萝卜素、花生四烯酸、角鲨烯、豆甾醇、谷甾醇和芦丁，提示这17 种共有有效成分对痛风作用较强，可能是红参祛痹饮液治疗痛风的关键成分。

2.5 PPI网络构建结果及拓扑学分析结果

2.5.1 PPI网络 PPI网络，见图 5。该网络包含 133 个节点，556 条边，平均节点度值为8.36，节点代表靶点，网络中节点内部的螺旋状结构表示靶点的三维立体结构，无填充的空白节点则表示未查询到相应靶点的3D结构。节点之间的连线代表不同靶点之间的相互作用，线条颜色对应不同蛋白互作类型，其中紫色（试验验证）和浅蓝色（数据库查询）线条为目前已被证实的蛋白互作关系，而红色（基因富集）、绿色（上下游基因）、深蓝色（基因共表达）线条则表示可能存在某种潜在作用关系；同源蛋白质或尚未验证的关系等均由其他颜色表示。此外，从PPI 网络图中可以看出，两个靶点之间有多条连线，说明靶点间存在多种复杂的互作关系。

图4 “药物-组分-有效成分-痛风-核心靶点”网络Fig.4 “Drugs-components-active ingredients-gout-core targets”network

图5 核心靶点PPI 网络Fig. 5 Core target PPI network

2.5.2 拓扑学分析结果 PPI 网络二次构建结果，见图6。拓扑学结果显示，STAT3、MAPK1、SRC、IL6、TNF、PTPN11、JUN、RELA、VEGFA、MAPK14、MAPK8、FYN、JAK1、APP、JAK2、STAT1、EGF 和 LYN 等靶点度（degree）值大于25，具有度值高、介数中心性（betweenness centrality）大、高连通性等特点，在网络中起着重要的作用，故以上述18 个靶点作为红参祛痹饮液治疗痛风的候选关键靶点。将上述18 个靶点名称、度值和介数进行汇总，见表1。

图6 Cytoscape3.7.2 构建的PPI 网络Fig. 6 PPI network constructed by Cytoscape 3.7.2

表1 18 个候选关键靶点Table 1 18 candidate key targets

2.5.3 Hub基因及关键基因的筛选结果 在PPI 网络拓扑学分析基础上，利用Cytohubba 插件筛选得到10个 Hub 基因，Degree ≥ 28，构建 PPI 核心靶点网络见图7。节点平均度值为33.5，其中节点颜色深浅与度值呈正相关，即越接近红色表示度值越大，越趋近于黄色，度值越小。明显看出，STAT3、MAPK1、SRC、IL6、TNF和PTPN11 颜色较深，且包含于上述18 个候选关键靶点，提示它们在网络中的重要性较高，故选取STAT3、MAPK1、SRC、IL6、TNF 和 PTPN11 作为关键靶点。除了这6 个关键基因外，找到与关键基因密切相关的邻居基因，作为次关键基因，为进一步分析发挥作用。通过Cytoscape 3.7.2 软件找出关键基因的邻居基因，见表2。

表2 6 个关键靶点及其邻居基因Table 2 Six key targets and their neighbor genes

2.6 GO 分析及 KEGG 分析结果

2.6.1 GO 生物过程富集分析结果 共得到53 个具有代表性的富集结果，其中生物过程（biological process，BP）条目27 个，分子功能（molecular function，MF）条目 11 个，细胞组成（cellular component，CC）条目 15 个。直方图，见图8。柱状图越高，表示富集程度越显著。结果显示，GO-BP 富集程度最高，核心靶点主要富集于细胞过程（cellular process）、生物调节（biological regulation）和应激反应（response to stimulus）等生物过程，提示红参祛痹饮液可能主要通过上述生物过程发挥治疗痛风的功效。

图8 红参祛痹饮液GO 富集分析Fig. 8 GO enrichment analysis of red ginseng qubi decoction

2.6.2 KEGG 信号通路分析结果 KEGG 高级气泡图，见图9。点的大小与基因数目有关，气泡颜色代表P 值的大小，横坐标代表富集分数，纵坐标标注了12条信号通路名称。其中Ras 信号通路、Focal adhesion信号通路和Toll-like 信号通路对应气泡较大，表示参与KEGG 通路的靶点较多，推测这几条通路是红参祛痹饮液治疗痛风的重要通路。对KEGG 通路及在通路中富集的靶点进行了汇总，见表3。

图9 红参祛痹饮液KEGG 富集气泡图Fig.9 Bubble chart of KEGG enrichment about red ginseng qubi decoction

表3 红参组的KEGG 通路及相应靶点Table 3 The KEGG pathways and corresponding targets of red ginseng

续表3

2.6.3 “化合物-靶点-通路”图 由图10 可知，该网络包含198 个节点，812 条边，每种有效成分可作用于多个靶点，每个靶点连接多种成分，体现了红参祛痹饮液治疗痛风具有多成分、多靶点的特点。环形外圈是有效成分，不同颜色代表属于不同种类的中草药，黄色菱形是13 种中草药，浅灰色是筛选的通路，中间是通路涉及的痛风靶点，不同大小的结构代表节点与其他节点相连的多少，即度值高低，形状越大度值越大，说明相应的中草药、成分、通路、靶点越重要。比如中草药中的桑叶、栀子、红参；成分中的人参皂苷Rh2、人参皂苷Rh4、山柰酚和木犀草素等；通路中的Ras、Toll-like receptor 和 PI3K-Akt signaling pathway 等；靶点中的TNF、VEGFA、PIK3CG、JUN和BCL2 等。此外，网络中多条通路之间通过共有靶点连接，而非独立分开，说明各通路之间协同发挥作用，从而达到治疗痛风的目的。

图10 “红参祛痹饮液-靶点-通路”网络Fig. 10 “Red ginseng qubi decoction-targets-pathways”network

3 结论与讨论

本研究利用网络药理学技术，共获取148 种红参祛痹饮液有效成分，989 个有效成分靶点，1 015 个痛风靶点及183 个核心靶点；通过“药物-组分-有效成分-痛风-核心靶点”网络及拓扑学分析结果，筛选得到6个红参祛痹饮液抗痛风的关键靶点（STAT3、MAPK1、SRC、IL6、TNF 和 PTPN11）；根据核心靶点的 GO 和KEGG 分析结果，筛选得到4 条可能的信号通路（Ras、Toll 样受体、PI3K-AKT 和 TNF 信号通路）。初步预测了红参祛痹饮液抗痛风的作用机制。

王亚杰[29]研究发现山柰酚和木犀草素在一定浓度时对黄嘌呤氧化酶的抑制具有协同效应。黄嘌呤氧化酶是体内产生尿酸过程中的一个关键性酶，是产生痛风的重要因素之一。木犀草素通过下调Toll 样受体（Toll-likereceptors，TLR）/核因子 B（nuclearfactorkappa-B，NF- B）通路可减轻急性痛风性关节炎症的作用[30]。

朱月莉[31]研究发现Toll 样受体是一种治疗痛风的潜在通路，其中的白细胞介素和肿瘤坏死因子是影响痛风的关键基因；此外，痛风会诱发神经营养不良，在预测到的通路中，Focal adhesion signaling pathway可能会对此产生调节作用[32]。与痛风相关的高尿酸血症可能会加速肿瘤进展，增加癌症风险，在预测所得通路中，Ras signaling pathway 等信号通路与肿瘤的增长密切相关，通过调节肿瘤相关通路对通风并发症的增长起到抑制作用[33]。IL-10 信号通路主要作用于抑制痛风炎性因子合成过程，阻断促进炎性细胞因子的释放，从而达到治疗痛风的作用[34]。研究显示，痛风结晶尿酸单钠（MSU）对PI3K-AKT 有一定激活作用，说明PI3K-AKT 可调节痛风的相关靶点[35]、MSU 晶体也可激活MAPK 途径，对痛风有一定治疗作用[36]；沉积在滑膜和软骨中的MSU 晶体能激活免疫细胞，如单核细胞、多形核细胞和淋巴细胞，以诱导促炎性细胞因子释放，这些因子包括白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1（IL-1 ）和肿瘤坏死因子（TNF），它们会导致软骨和骨破坏，增加痛风炎症风险，但通过药物进行靶向性调节已达到预防和治疗的效果[37]。

与之前的红参祛痹饮液研究相比，此次采用网络药理学的方法对其进行了成分、靶点和信号通路的预测，是红参祛痹饮液抗痛风的首次网络预测分析，这将为后续研究提供思路和理论依据。