刘国强　海小　罗建兴

摘要：禽源性成分检测既可以预防禽流感又能分析肉类的掺假问题。本研究参考行业标准（SN/T 2727-2010），对鸭和其它12种不同源性动物DNA进行特异性检测;将鸭来源DNA模板原液进行梯度稀释确定其检出限，同时进行灵敏度实验和掺假实验;在加工制品中检测其适用性。结果表明：此引物和探针特异性强，只针对鸭有特异性扩增曲线，对其它12种动物源性无扩增曲线;当鸭模板DNA浓度为10fg·μL-1时，仍能检测到鸭源性，灵敏度可达到1%，同时可以很好地检测掺假;此引物和探针在加工制品中检测结果良好，适用于加工肉制品的检测。本实验通过所建立标准曲线y=-3.4554x+42.663，R2=0.9942，其PCR扩增效率为95%，可以有效地进行定量。同时利用灵敏度检测可以判断此方法的掺假检测能力较强。综上所述，本研究可以有效检测鸭源性的掺假问题，并能为标准提供一定的借鉴。

关键词：鸭源性成分;特异性;检出限;灵敏度;加工制品;定量检测

中图分类号：S-3

文献标识码：A

作者简介：刘国强（1994-），男，本科，研究实习员。研究方向：动物源性成分检测和转基因成分检测;通讯作者郭梁（1986-），男，博士，助理研究员。研究方向：动物源性成分检测和转基因成分检测以及微生物资源开发。

肉类是人们饮食中不可缺少的一部分，其含有多种营养物质（如蛋白质、脂肪以及微量元素等）[1，2]。目前在肉及肉制品的生产和运输中会时常发生一些掺假的问题[3-6]，如将鸡、鸭肉（低价肉）掺杂到牛、羊肉（高价肉）中。动物源性检测技术针对上述问题，除了能保护消费者合法权益、维持市场公平交易机制，还能预防动物来源性疾病的传播（疯牛病、口蹄疫、牛海绵状脑病等）[7-10]。

目前，动物源性检测技术建立在对样品蛋白质、脂肪酸以及核酸等种属特异分子鉴别肉与肉制品的动物来源[11-15]。动物源性检测所涉及的技术手段包括电泳[16，17]、免疫组化[18，19]、质谱[20]、色谱[21]、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction， PCR）[22，23]。因为脱氧核糖核酸（DNA）的热稳定性[24]，使得以DNA为基础的PCR技术成为了检测动物源性检测主流技术[25，26]。其中，荧光染料（SYBR Green 或Eva Green）[27，28]和TaqMan探针[29，30]成为了PCR检测的主要技术。探针技术因为其种属特异性探针提高了实时荧光PCR的扩增效率和特异性，从而快速并且准确地得到检测结果。

本文参考行业标准（SN/T 2727-2010）[31]，建立肉与肉制品中鸭源性成分的TaqMan实时荧光PCR检测方法，保证鸭源性成分的快速检测，规范食品市场。

1材料与方法

1.1样品准备

鲜肉及加工肉制品均购买于本地农贸市场，鲜肉包括鸭肉、羊肉、牛肉、猪肉、马肉、鹿肉、驴肉、兔肉、狗肉、鹌鹑肉、鸡肉、火鸡肉和鸽子肉。加工肉制品包括口口丫鸭翅根、口口丫蜜汁烤腿、金锣火腿肠、肉粒多火腿肠、尚清斋烤肠、蒙羊羊肉干、呼纳斯牛肉干。样品采集处理去除脂肪，并用灭菌水清洗，置于-20℃保存。

1.2试剂

TransStart Probe qPCR SuperMix （北京全式金生物技术有限公司）;实时荧光定量PCR引物和探针合成（北京睿博兴科公司）;Takara MiniBEST Universal基因组提取试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司）。

1.3仪器

Eppendorf 5418R Centrifuge高速台式离心机（德国Eppendorf AG公司）;Nanodrop 2000c 核酸蛋白测定仪（美国Thermo Fisher公司）;7300plus实时荧光PCR扩增仪（美国ABI公司）。

1.4方法

1.4.1引物和探针

引物和探针均由北京睿博兴科公司合成。引物与探针序列如下表1。

1.4.2DNA提取

取1.1準备好的鲜肉和肉制品样品，利用Takara MiniBEST Universal基因组提取试剂盒其DNA，利用Nanodrop 2000c核酸蛋白分析仪测量其浓度，将母液稀释至100ng·μL-1左右，保存于-20℃。

1.4.3反应体系与反应条件

反应体系（总体积20μL）：TransStart Probe qPCR SuperMix 10μL，左右引物各1μL，探针1μL，模板2μL，补ddH2O至20μL。

反应条件：95℃5min，1个循环;95℃5s，60℃30s，45个循环，在每次循环退火时收集荧光信号。

1.4.4特异性实验

分别取鸭、羊、牛、猪、马、鹿、驴、兔、狗、鹌鹑、鸡、火鸡和鸽子13种不同源性动物DNA模板进行鸭源性特异性分析实验。

1.4.5检出限检测实验

从100ng·μL-1的鸭肉模板DNA稀释液加灭菌ddH2O开始稀释，每1/10稀释1次，共稀释7次。分别为100ng·μL-1、10ng·μL-1、1ng·μL-1、0.1ng·μL-1、0.01ng·μL-1、0.001ng·μL-1、0.0001ng·μL-1、0.00001ng·μL-1的鸭肉模板DNA稀释液进行检出限检测实验。

1.4.6灵敏度和模拟掺假实验

将鸭肉DNA与羊肉DNA以一定比例混合，制成鸭肉DNA含量分别为1%、5%、10%、30%、70%、90%、95%、99%的混合DNA样品，进行模拟掺假检测实验，同时依照1.4.3反应体系对该方法的灵敏度进行分析，每次实验设3个平行。

1.4.7数据处理

利用Real-Time PCR Software 对结果进行扩增曲线和循环（Cycle threshold，Ct）的分析。每次实验结果都是3个平行实验的平均值±标准差表示。

2结果与分析

2.1特异性实验

将鸭、羊、牛、猪、马、鹿、驴、兔、狗、鹌鹑、鸡、火鸡、鸽子的模板DNA（如图1、表2所示），分别利用鸭的引物和探针进行实时荧光定量PCR实验，特异性扩增结果如图2所示，PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳处理之后如图3所示，产物条带均为单一条带，无非特异性扩增，说明引物和探针组合具有较高的特异性。由图2和表2可以看出，仅鸭的样品出现典型扩增曲线，Ct值为14.01±0.18（鸭肉样品1），13.92±0.35（鸭肉样品2），13.86±0.12（鸭肉样品3），13.78±0.43（鸭肉样品4），13.74±0.07（鸭肉样品5），其它12种动物（其它肉样：羊、牛、猪、马、鹿、驴、兔、狗、鹌鹑、鸡、火鸡和鸽子）均未有出现典型扩增曲线且Ct值均为0。

2.2检出限检测实验

通过鸭引物和探针对100ng·μL-1、10ng·μL-1、1ng·μL-1、0.1ng·μL-1、0.01ng·μL-1、0.001ng·μL-1、0.0001ng·μL-1、0.00001ng·μL-18个不同质量浓度梯度的样品DNA进行荧光定量PCR扩增实验。结果如图4所示和表3所示。由图4和表3可知，稀释至0.00001ng（即10fg）的鸭基因组DNA模板（3个平行实验）出现典型扩增曲线，Ct值为38.37±0.19;以扩增结果Ct<40时判定为确认检出，上述结果表明此探针已达到检出限度，说明鸭特异性引物和探针的检测限度可达到10fg。

2.3定量检测

利用100ng·μL-1、10ng·μL-1、1ng·μL-1、0.1ng·μL-1、0.01ng·μL-1、0.001ng·μL-1、0.0001ng·μL-1、0.00001ng·μL-1的鸭肉模板DNA稀释液，进行引物和探针的检测，制作鸭源性定量检测标准曲线，如图5所示。所得鸭的特异性探针的標准曲线为y=-3.4554x+42.663，R2=0.9942。由于PCR扩增效率E（%）=[10（-1/slope）-1]×100，其PCR扩增效率为95%，PCR效率的接受范围在90%～110%[32，33]，对应于回归斜率在-3.1～-3.6，R2值≥0.98。综上所述，此方法具有较好的定量检测能力。

2.4灵敏度实验

因为鸭肉经常被掺杂到羊肉中，所以本实验通过鸭引物和探针对鸭组分DNA和羊组分DNA混合样（鸭组分含量分别为1%、5%、10%、30%、70%、90%、95%、99%）进行模拟掺假实验，结果如图6所示，具体数值如表4所示。由图6和表4可知，当混合DNA样品中鸭组分含量为1%时，出现典型的扩增曲线，Ct值为27.34±0.71。因为当混合DNA样品中鸭组分含量为1%时，3个平行中均出现典型的扩增曲线，所以可以证明此探针对鸭肉掺假羊肉检测效果明显，同时上述结果能充分证明此引物和探针具有较高的灵敏度。

2.5加工肉制品的检测

提取1.1中已处理好加工肉制品的DNA，进行实验。其扩增曲线结果和Ct值如表5和图7所示。

3讨论

与实时荧光PCR技术相比，普通PCR检测的普遍弱点就是耗时长[25-27]，检测人员常常需要花费大量时间来对实验进行重复工作，而且一个实验结果通常都需要进行一系列实验才能得出。而实时荧光定量PCR由于添加了TaqMan探针和荧光信号，使得其灵敏度与特异性都高于普通PCR，特别是检测大批量样品时其优势尤为明显。实时荧光定量PCR不仅能够实时监测，同时得到检测的结果迅速，在1～2h就可以得到结果，而且结果简单直观，易于分析。

本研究通过出入境检验检疫行业标准（SN/T 2727-2010）合成检测鸭源性成分的引物和探针，通过实验探索了最佳的反应体系和反应条件。创新点在于基于行业标准，增加了特异性实验、检出限实验、模拟掺假实验和适用性实验，并且通过建立标准曲线来评价方法的定量检测能力。本研究对鸭、羊、牛、猪、马、鹿、驴、兔、狗、鹌鹑、鸡、火鸡和鸽子13种不同源性动物进行特异性实验。结果显示，只有鸭肉有特异性扩增，其它动物均没有;将鸭来源的DNA模板原液进行浓度梯度稀释，分别为100ng·μL-1、10ng·μL-1、1ng·μL-1、0.1ng·μL-1、0.01ng·μL-1、0.001ng·μL-1、0.0001ng·μL-1、0.00001ng·μL-1的鸭肉模板DNA稀释液进行检出限检测实验，检出限为10fg;建立标准曲线，其PCR扩增效率为95%，在90%～110%，标准曲线R2=0.9942≥0.98可以评价此引物和探针定量检测能力较好。同时还将鸭模板DNA与羊模板DNA按照1%、5%、10%、30%、70%、90%、95%、99%体积比例混合来模拟掺假实验。结果显示，鸭模板DNA体积比例为1%时仍可以检测到鸭源性，同时证明此引物和探针的灵敏度可达1%。通过实时荧光PCR在鸭翅根、蜜汁烤腿、金锣火腿肠、肉粒多火腿肠、尚清斋烤肠、蒙羊羊肉干、呼纳斯牛肉干进行适用性实验，只有在具有鸭源性的鸭翅根和蜜汁烤翅中才能检测到鸭源性，说明此引物和探针适用性较好。

本方法的检出限为10fg，在本研究中的引物和探针组合与已报道的研究相比具有较大的优势，同时检出限已超越了之前的研究[37-39]。林彦星等[40]建立了实时荧光定量PCR检测畜禽肉制品中的鸭源性成分，可检测到1.0pg鸭源DNA的存在;金萍等[41]基于鸭线粒体细胞色素Cytb基因建立了肉制品中鸭源性成分检测的Real-time PCR检测方法，检出限为8pg;史艳宇等[42]建立了一种快速、特异、灵敏的鸭源性成分检测方法，其检出限为1.0mg;张弛等[43]建立肉制品中鸭源性成分定性和定量检测的检出限达到1.78pg;张秀平等[44]设计可特异检测鸭肉成分的引物和探针，其检出限为1pg;程欣[45]建立了添加有扩增内标的用于检测食品中鸭肉成分的实时荧光PCR方法，可检出0.05ng的鸭DNA;董洋洋[46]建立了鉴别鸭肉单一成分的实时荧光PCR的方法检测快速准确，检出限可达0.2ng。上述研究的检出限均低于本研究。

綜上所述，此方法具有较强的特异性、较高的灵敏度和适用性广等特点。可以有效检测掺假，从而维护消费者权益和防止禽类疾病的传播，为推动肉类食品领域向透明化、标准化发展提供技术支持。

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（责任编辑 李媛媛）