张贤玉　李佳宁　刘召阳　黄丽丽　冯浩

摘要：鼠李糖脂是一种生物代谢性质的表面活性剂，近年来被认为具有开发为生物源农药的潜力而备受关注。为了揭示鼠李糖脂对常见植物病害的生防潜能，本研究评价了其对7种常见植物病原菌的室内抑菌活性，并揭示了鼠李糖脂处理对灰葡萄孢（Botrytis cinerea）菌丝形态的影响。结果发现，鼠李糖脂对所有供试菌株菌丝生长均有一定的抑制效果，其中对B. cinerea效果最为明显，EC50为0.51μL·mL-1;组织学观察发现鼠李糖脂处理后B. cinerea菌丝出现分支增多、畸形等现象。可见，鼠李糖脂在药剂开发方面具有较大潜力，为其进一步研究与应用提供了一定的理论指导。

关键词：EC50;菌丝形态观察;生防潜力;鼠李糖脂;抑菌活性

中图分类号：S-3

文献标识码：A

作者简介：张贤玉（2000-），男，本科在读。研究方向：植物保护。

病害是威胁作物安全生产的重要生物因素之一。当前防控植物病害依旧主要依赖化学药剂，但是长期单一施用化学药剂会带来抗性风险、农药残留及环境污染等问题。因此，开发应用高效低毒的生物源药剂变得越来越重要。鼠李糖脂是由假单胞菌或伯克氏菌类产生的一种生物代谢性质的生物表面活性剂。近年来，凭借低毒、可降解的优势，在堆肥、促进植物养分吸收以及土壤修复等方面受到关注[1-3]。在植物病害防控应用方面，发现鼠李糖脂具有诱导植物抗性、抑制菌丝生长、水解病菌孢子、抑制孢子萌发以及阻止孢子移动等作用，个别国家已经将鼠李糖脂作为生物农药备案[4，5]。然而，我国对鼠李糖脂的研究主要集中在食品、医药和环境保护等方面，对其在真菌病害防控方面的研究较少。

为了揭示鼠李糖脂对常见植物病害的生防潜能，本研究评价了其对7种常见植物病原菌的抑菌活性，并揭示了其对B.cinerea菌丝形态影响，为鼠李糖脂的进一步研究与应用提供一定的理论指导。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试菌株

供试菌株见表1。1.1.2培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）用于供试菌株培养及药效测定。

1.1.3供试药剂

鼠李糖脂原液，由浙江东杰生物科技有限公司提供。

1.2试验方法

1.2.1供试菌株对鼠李糖脂的敏感性测定

用灭菌水将鼠李糖脂原药稀释成特定浓度的母液，吸取不同体积母液加入PDA培养基中，充分混合均匀，倒入培养皿制成不同浓度的含药平板（表2）。以PDA培养基作为空白对照，每个浓度设置3次机械重复，试验重复3次。

挑取待测病菌菌丝于空白PDA培养基25℃黑暗培养3d。打孔器灭菌后在菌落边缘打取直径为5mm的菌饼，倒置接种于含药平板中央，25℃黑暗培养。利用十字交叉法测量皿内菌落直径，计算菌丝生长抑制率，所用公式如下：

菌丝生长抑制率=[（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）]×100%

以药剂浓度的对数值为横坐标（x），菌丝生长抑制率为纵坐标（y），作线性回归分析，计算鼠李糖脂对供试菌株菌丝生长的EC50值和相关系数R2。

1.2.2鼠李糖脂对B.cinerea的菌丝形态影响观察

将B.cinerea接种于空白PDA培养基（对照组）和1.00μL·mL-1浓度含药培养基上。25℃黑暗培养2d后，挑取菌落边缘，置于载玻片，利用光学显微镜观察2组菌丝的形态差异。

2试验结果

2.1供试菌株对鼠李糖脂的敏感性

试验结果发现，鼠李糖脂对供试菌株菌丝生长均有一定抑制作用（表3、图1）。其中对B.cinerea菌丝生长抑制作用最为明显，EC50为0.51μL·mL-1。对V.mali、B.dothidea、F.spp.、C.gloeosporioides、P.capsici抑制效果较好，EC50在1.13～4.76μL·mL-1;对S.sclerotiorum抑制效果较差，EC50为24.20μL·mL-1。

2.2鼠李糖脂对B.cinerea的菌丝形态影响

1.00μL·mL-1鼠李糖脂处理2d后，B.cinerea菌丝形态发生明显变化，处理组较对照组菌丝分支明显增多（图2a-A）;处理组菌丝出现畸形，多扭曲，少数膨大，对照组则菌丝细直，不弯曲（图2b-B）;处理组细胞长度变短，较对照组细胞明显缩短（图2c-C）。

3讨论

《全国农业现代化规划（2016—2020年）》指出，我国农业现代化已经进入了新的发展阶段，但仍然面临粮食生产安全、食品质量安全、农田环境污染等众多问题，其中长期单一过量使用化学药剂进行植物病害防控存在农业污染、农药残留、病原菌抗药性增强等系列问题。因此，生物源药剂的研发和应用具有重要意义。鼠李糖脂是一种由1～2个鼠李糖分子与1～2个β-羟基脂肪酸形成共价结构而组成的一类糖脂分子。其是一种非常有效的生物源表面活性剂，在国际化、绿色化背景下，鼠李糖脂以其低毒、可降解的优点，在堆肥、土壤修复等各方面的应用中获得越来越多的关注。

前期已有研究发现，鼠李糖脂能够水解瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）等卵菌的孢子[6-8]，并能夠抑制甘蔗镰孢霉菌（Fusarium sacchari）、尖镰孢菌（Fusarium oxysporum）等真菌的菌丝生长[9，10]。同时，能够抑制茄链格孢菌（Alternaria solani）和辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）的孢子萌发[11，12]。特别是在番茄灰霉病防控方面，Varnier等[13]发现鼠李糖脂能够提高植物几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶基因的表达水平激活植物PTI从而提高植物对灰霉病的防控效果。本研究评价了鼠李糖脂对7种常见植物病原菌的抑菌活性，并揭示了其对B.cinerea菌丝形态影响。研究结果发现，鼠李糖脂对供试菌株均有一定的抑制效果，其中对B.cinerea的抑菌效果最为显著。由此可见，鼠李糖脂具有较大的开发为生物源药剂的潜能。

参考文献

[1]赵佳佳.鼠李糖脂二糖脂对堆肥中木质纤维素酶解的影响[D].长沙：湖南大学，2009.

[2]张莉.打顶和鼠李糖脂处理对西瓜前期生长及养分吸收效率的影响[D].杭州：浙江大学，2011.

[3]张泽霆.鼠李糖脂海水洗涤—生物降解修复沿海石油污染土壤的研究[D].舟山：浙江海洋大学，2018.

[4]刘菊.鼠李糖脂对西瓜枯萎病防治作用的研究[D].杭州：浙江大学，2012.

[5]王蕾，毛玉玲，许汉亮，等.鼠李糖脂防治植物真菌病害研究进展[J].广东农业科学，2017，44（08）：90-95.

[6]Kim BS， Lee JY， Hwang BK. In vivo control and in vitro antifungal activity of rhamnolipid B， a glycolipid antibiotic， against Phytophthora capsica and Colletotrichum orbiculare [J]. Pest Management Science， 2000， 56（12）： 1029-1035.

[7] Stanghellini ME， Miller RM. Biosurfactants： Their identity and potential efficacy in the biological control of zoosporic plant pathogens [J]. Plant Disease， 1997， 81（1）： 4-12.

[8] De Jonghe K， De Dobbelaere I， Sarrazyn R， et al. Control ofPhytophthora cryptogea in the hydroponic forcing of witloof chicory with the rhamnolipid based-biosurfactant formulation PRO1[J]. Plant Pathology， 2005， 54（2）： 219-226.

[9] Goswami D， Handique PJ， Deka S. Rhamnolipid biosurfactant againstFusarium sacchari the causal organism of pokkah boeng disease of sugarcane[J]. Journal of Basic Microbiology， 2014， 54（6）： 548-557.

[10] Borah SN， Goswami D， Lahkar J， et al. Rhamnolipid produced by Pseudomonas aeruginosa SS14 causes complete suppression of wilt by Fusarium oxysporum f. sp. pisi in Pisum sativum[J]. BioControl， 2015， 60（3）： 375-385.

[11] Lahkar J， Borah SN， Deka S， et al. Biosurfactant of Pseudomonas aeruginosa JS29 against Alternaria solani： the causal organism of early blight of tomato [J]. BioControl， 2015， 60（3）： 401-411.

[12] Lahkar J， Goswami D， Deka S， et al. Novel approaches for application of biosurfactant produced by Pseudomonas aeruginosa， for biocontrol of Colletotrichum capsica， responsible for anthracnose disease in chilli[J]. European Journal of Plant Pathology， 2018，150（1）： 57-71.

[13]Varnier A L， Sanchez L， Vatsa P， et al. Bacterial rhamnolipids are novel MAMPs conferring resistance to Botrytis cinerea in grapevine[J]. Plant， Cell & Environment， 2009， 32（2）： 178-193.

（責任编辑 周康）