向 俊 唐万里 刘 慧 赵红清

(湖南省食品质量监督检验研究院，湖南 长沙 410000)

磺胺类药物是一种广谱抗菌药，性质稳定，临床上主要用于预防和治疗感染性疾病。在兽医临床和畜牧养殖业中，因其能够有效治疗和预防细菌性疾病及寄生虫病而常作为饲料添加剂或动物疾病治疗药物进行使用[1]。由于磺胺类药物的半衰期较长，通过任何途径摄入的磺胺类药物均会在人体中蓄积，引起过敏反应或者使病原有机体产生抗药性，甚至致癌[2-3]。因此，很多国家对磺胺类药物的使用范围及其在动物源性食品中的残留限度进行了严格的规定。中国农业部公告第235号[4]对磺胺类药物在畜禽肉及其副产物中的残留限量值进行了明确规定：畜禽肉中的磺胺类药物限量值为100 μg/kg。随着社会的发展和生活水平的提高，磺胺类药物的不合理应用导致其在动物性食品中残留而引起的生态环境污染和对人体健康危害的问题备受关注。

用于磺胺类药物残留的分析方法主要有高效液相色谱法[5-6]、液—质联用法[7-8]、免疫测定法[9-10]等，其中液相技术分析方法因准确度高、分离度好等优点而被广泛研究，已从单一的液相色谱法、液—质联用法发展到液相色谱—质谱/质谱法[11-14]，前处理方法也从简单提取发展到微萃取、固相萃取、加速溶剂萃取等优化方法[15-18]，目前，该类方法仍然存在检测种类少、基质干扰多、方法灵敏度不足等缺点。目前湖南地区对畜禽肉中磺胺类药物残留的检测主要依据GB/T 21316—2007进行，由于该方法灵敏度较低，一直存在检出率不高的问题。近些年针对湖南地区畜禽肉中磺胺类药物检测研究较少，相关文献也未见报道。研究拟通过优化固相萃取样品前处理，采用液相色谱—质谱/质谱联用的检测手段，对湖南各地区生产及销售的300余批次的畜禽肉样品中的磺胺类药物残留情况进行检测分析，旨在为湖南地区畜禽肉中磺胺类药物残留监管提供可靠依据，以及为解决磺胺类药物残留问题提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、甲氧苄啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉10种磺胺类标准品：纯度≥99%，北京坛墨质检科技有限公司；

乙腈、正己烷：色谱纯，上海安谱科学仪器有限公司；

正丙醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

液相系统：SHIMADZU Nexera X2型，日本岛津仪器有限公司；

质谱系统：AB SCIEX QTRAP®4500型，美国AB仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制 分别称取上述标准品各10 mg 于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，摇匀，配制成100 μg/mL的储备液，于4 ℃冰箱保存。将标准储备液用乙腈稀释至所需的标准系列浓度，待用。

1.2.2 液相条件 色谱柱为Hypersil GOLD(100 mm×2.1 mm，3 μm)；流动相：A为0.1%甲酸—5 mmol/L乙酸铵水溶液，B为甲醇溶液；柱温35 ℃；样品温度15 ℃；进样量5 μL，洗脱梯度：0.0～2.0 min，5% B；2.0～4.0 min，5% B～15% B；4.0～5.0 min，15% B；5.0～8.0 min，15% B～40% B；8.0～10.0 min，40% B～95% B；10.0～16.0 min，95% B；16.0～16.5 min，95% B～5% B；16.5～20.0 min，5% B。

1.2.3 质谱条件 系统：AB SCIEX QTRAP®4500；离子源：ESI+；采集方式：MRM；离子化电压：5.5 kV；离子源温度：450 ℃；喷雾气275 800 Pa；辅助加热气275 800 Pa；气帘气172 375 Pa。

1.2.4 样品处理 称取样品2 g置于玻璃研钵中，再称取约6 g(精确至0.01 g)C18填料加至试样上用玻璃杵轻轻研磨，使样品和填料混合均匀，装于50 mL具塞螺旋盖聚四氟乙烯离心管中，加入25 mL乙腈—水(体积比100∶3)溶液，涡旋振荡1 min，于家用微波炉中在光波模式下微波辐照30 s，3 000 r/min离心5 min，将乙腈层移入100 mL棕色分液漏斗中。离心后的沉淀再加入25 mL乙腈摇匀，微波辅助提取30 s，3 000 r/min离心5 min，合并乙腈提取液，待净化。提取液中加入25 mL乙腈饱和正己烷溶液，振荡5 min，将底层乙腈溶液移入150 mL棕色鸡心瓶中，加入10 mL正丙醇，用旋转蒸发仪于45 ℃水浴中减压蒸发至近干，氮气流吹干。准确加入1 mL乙腈—水(体积比1∶1)溶液，超声30 s溶解残渣，将溶解液移入10 mL棕色离心管中，加入0.5 mL乙腈饱和的正己烷，涡旋2 min，3 000 r/min离心5 min，弃去正己烷溶液，取底层乙腈—水溶液过0.22 μm微孔滤膜，供UPLC-MS/MS测定。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

2.1.1 质谱条件 将磺胺分别配成100 μg/L的标准溶液，不经色谱柱，直接质谱进样，根据磺胺类药物分子的化学结构特征，选用ESI+离子化模式，进行母离子扫描和子离子扫描，优化二级碎片离子信息，获得定性离子和定量离子最佳质谱条件，具体见表1。

表1 10种磺胺类药物质谱参数

2.1.2 液相色谱条件优化 前期预试验比较了甲醇—水、甲醇—0.1%甲酸水、甲醇—0.1%甲酸，5 mmol/L乙酸铵水对各化合物的色谱峰及离子化的影响，结果发现由于磺胺类药物的结构中带有氨基，呈弱碱性，在ESI+离子化模式下，各磺胺类化合物在中性或碱性流动相体系中的色谱峰形不理想，而在流动相中加入一定比例的甲酸能够明显提高离子化效率，且加入少量的乙酸铵更能兼顾不同极性磺胺类药物的离子化效率。因此，选择甲醇—0.1%甲酸，5 mmol/L乙酸铵水作为流动相，各磺胺类化合物峰形较好，响应较高，各磺胺类标准溶液MRM色谱图见图1。

2.1.3 基质效应 按1.2.4方法处理空白禽肉，添加一定量混合标准溶液制成基质加标溶液，与溶剂加标溶液进行比较，结果发现10种药物均存在不同程度的基质抑制情况。因此，检测过程中采用空白基质进行标准曲线配制。

2.1.4 线性范围及方法的检出限 准确量取1.2.1项下磺胺类标准溶液适量，分别以空白禽肉(以鸡肉为代表)基质做溶剂，稀释制备成浓度为10.0，20.0，50.0，100.0，200.0，500.0 ng/mL的系列标准溶液，按1.2色谱条件分析，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得各磺胺类药物线性回归方程，结果见表2，10种磺胺类药物在2.0～500.0 ng/mL范围内，线性关系良好，相关系数均大于0.99。以信噪比S/N=10确定10种磺胺类的定量限为50 μg/kg。

表2 10种磺胺类药物的线性方程、相关系数、线性范围及定量限

2.1.5 回收率及精密度 分别称取空白鸡肉5.0 g，添加3种不同浓度(20，100，200 μg/kg)的10种磺胺类药物，每个浓度6份，按1.2.4方法进行前处理，计算各磺胺类药物的回收率和精密度，结果见表3，鸡肉样品中10种磺胺类药物在20，100，200 μg/kg加标水平下的回收率范围分别为80.1%～90.0%，80.6%～91.1%和84.7%～96.4%，相对标准偏差(RSD)范围分别为4.1%～8.8%，3.7%～9.2%和3.3%～8.8%，表明试验方法回收率和精密度良好，可满足试样的分析要求。

表3 不同浓度磺胺类药物在鸡肉中的回收率及精密度

2.2 方法应用

2.2.1 畜禽肉样品中磺胺类药物含量水平 采用试验建立的分析方法对购自湖南省各个地区的共325批次畜禽肉样品进行磺胺药物残留检测，结果见表4。10种磺胺药物中，甲氧苄啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑3种药物有检出，其中磺胺甲噁唑检出2批次，检出率为0.62%；磺胺间甲氧嘧啶检出3批次，检出率为0.92%；甲氧苄啶检出16批次，检出率高达4.92%。甲氧苄啶作为抗菌药使用范围非常广，除单独使用外，还常与磺胺类药物联用，不仅可增加抗菌力，还可使抗菌谱扩大[19]。其检出率高主要是因生产者普遍使用该药物且未规范用量导致。

表4 湖南地区畜禽肉样品中10种磺胺类药物含量†

2.2.2 湖南省不同地区畜禽肉样品中磺胺类药物含量水平对比 325批次样品购自湖南省内14个不同地区，其中长沙、益阳等7个地区的样品检出磺胺类药物，将14个地区畜禽肉样品检出的磺胺含量取平均值进行比较，结果见图2。14个地区中，长沙、益阳、湘潭、怀化、张家界、邵阳、娄底7个地区畜禽肉样品中检出磺胺类药物，磺胺检出平均值最低的为长沙市(66.2 μg/kg)，最高的为娄底市(101 μg/kg)，与国家食品安全监督抽检允许的磺胺类最大限量值(100 μg/kg)相比，邵阳、娄底地区的畜禽肉磺胺类药物残留风险性较高，可能与近年来邵阳、娄底地区出现禽流感等畜禽类疾病现象相对较多，生产者为防治畜禽类疾病而加强磺胺等药物的使用有关。

图2 湖南不同地区畜禽肉样品中10种磺胺类药物的含量

2.2.3 磺胺类药物在畜禽肉样品细类中差异情况 325批次畜禽肉样品中有8批次乌鸡肉、2批次土鸡肉、1批次普通鸡肉、3批次猪肉、2批次猪内脏、2批次牛肉、3批次羊肉检测出磺胺类药物，总体检出率达到5.92%，除鸭肉样品外，其他类样品均有检出磺胺类药物，详细结果见表5。其中有11批次鸡肉类产品检出磺胺类药物，占检出总批次数(21批次)的52.4%，说明磺胺类药物在鸡肉样品中残留的风险性较大，特别是乌鸡肉中磺胺类药物检出率达到了乌鸡肉样品总数的32.0%；与鸭、鹅等需要依靠水域活动生长的禽类饲养方式不同，养殖场大多将鸡关在笼中饲养，狭小的生长环境、极高的个体密度、有限的通风条件，都使鸡在养殖过程中出现疾病的概率性相对较高；乌鸡由于其营养价值和药用价值高，其饲养成本和售价都要高于普通鸡种，养殖者为防治乌鸡疾病，降低风险，对药物的使用可能比一般鸡种更频繁[20]。检出磺胺的8种畜禽肉样品细类中，检出磺胺种类数均为1种，说明湖南省内单个畜禽肉细类的磺胺类药物给药可能比较单一。

表5 10种磺胺类药物在湖南地区畜禽肉样品细类中的检出情况

3 结论

研究通过优化前处理方法，实现了液相色谱—质谱/质谱法快速测定湖南省内畜禽肉中10种磺胺类药物残留。通过分析发现，湖南省畜禽肉中磺胺类药物残留的风险性依旧存在，尤其是甲氧苄啶在鸡肉类样品中残留的风险性较高，不同区域、不同产品中磺胺类药物残留的水平差异性较大。建议加强对市场上鸡肉类样品的抽查力度，在加强食品安全监管的同时，也应当加强对畜禽肉生产商的食品安全意识培训和畜禽安全用药培训，使生产者能够合理用药、安全用药，药物研发环节也应当注重于研发对人体危害性更小的畜禽疾病防治用药。