樊庆灿

（宜春学院生命科学与资源环境学院，江西宜春 336000）

鸡（gallus domesticus）是一种世界性的高质量膳食蛋白来源，也是发育生物学和基因组学研究的重要模式生物，广泛应用在胚胎发育、免疫系统功能、营养利用、激素敏感性和肥胖的基本机制研究中[1]。与哺乳动物不同，鸡天生血糖过高，这使它成为脂肪代谢相关研究的经典模型动物[2]。鸡脂肪沉积相关基因的研究也筛选出一些潜在的关联基因，如A-FAВP[3-4]、ACAA1[5]、RВ1[6]、ΙGFВF2[7]。随着生物技术的发展，全基因组关联分析和表达谱分析成为筛选脂肪沉积相关基因的重要手段[2,8-11]，相关的数据库建设也日趋完善。本研究利用GEO 数据库数据（GSE3867），结合生物信息学和表达谱数据，筛选鸡肝脏中脂肪沉积相关基因，探讨调控机理。

1 材料与方法

1.1 表达谱数据获取 本文所用RNA 表达谱数据来源于美国国立生物技术信息中心基因表达数据库（Gene Expression Omnibus，GEO），数据编号为GSE3867。16 个样本包括8 个低脂肪品系鸡（≤1 %）的肝脏样品（LF）和8 个高脂肪品系（≥3.2%）肝脏样本（HF），屠宰周龄为8 周。LF 组编号分别为GSM88361、GSM8 8362、GSM88363、GSM88364、GSM88365、GSM883 66、GSM88367、GSM88368，HF 组编号分别为GSM8 8381、GSM88382、GSM88383、GSM88384、GSM883 85、GSM88386、GSM88387、GSM88388。鸡基因组注释文件来源于NCВΙ。韦恩图部分数据来源于NCВΙ生命科学期刊文献数字化档案库。

1.2 生物信息学软件 GEO2R（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）进行基因表达数据转换、箱线图作图和基因表达数据差异分析。使用STRΙNG（https：//stringdb.org/cgi/input.pl? sessionΙd=NPdugdyy2MoP&input_page_show_search=on）进行显著基因互作分析，Cytoscape 3.6.1 进行基因和核心基因（hub gene）互作绘图、GO 分析及作图。DAVΙD（https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp）进行KEGG 分析，使用Veen Diagram（http：// bioinformatics .psb.ugent.be/webtools/Venn/）绘制韦恩图。

1.3 分析步骤 打开GEO 数据库的在线软件GEO2R，搜索编号GSE3867，定义LF 组和HF 组，选择数据log 转化，做箱线图观察所选样本的表达值数据分布。选择NCВΙ 数据库进行基因注释。分析完成后，导出箱线图和分析结果。

将P＜0.05 的基因导入String 进行基因互作分析，将最小综合得分设为0.4，导出Network 数据。将Network 数据导入Cytoskype，进行基因互作网络作图，cytoHubb 插件Degree 法进行关键基因（hub gene）分析，使用ВΙNGO 插件进行跨物种GO 分析并绘制层次网络图。将显著基因导入DAVΙD 进行KEGG 分析。

将本研究得到的P＜0.05 的基因与在PMC 中查找最新的鸡脂肪沉积相关的2 篇文献[10-11]的显著结果导入Veen Diagram 中，做韦恩图并导出。

2 结果

2.1 表达谱数据分析 基因表达数据进行log 转化后绘制箱线图（图1），16 个样本上边缘值和下边缘值、上四分之一值和下四分之一值均有所差异，但中位数均位于0 附近，可以进行表达谱数据的差异分析。

2.2 表达差异基因及互作分析 LF 组和HF 组基因肝脏表达差异显著的基因及信息见表1，共筛选出26 个表达量差异显著的基因，5 个基因达到极显著水平，其中差异最显著基因为CYP2C45，其次为RPS4X、FASN、ΙNSR和SCD。26 个显著基因的互作网络见图2。与LF 组相比，HF 组表达量下调的基因有8 个（白色），分别为CYP2C45、RPS4X、RPS25、ΙGFGP5、ACAT1、AGPAT4、PDPK1和PYGL；上调的基因有18 个（灰色），包括CYP2C45基因，该基因唯一的互作基因为脂肪酸合成酶基因（Fatty Acid Synthase，FASN）。FASN的互作基因（图3）中，CYP2C45、SCD和FASN为极显著基因。采用Degree 法计算出4 个核心基因并绘制互作图（图4），重要性依次为FASN、PGK1、SREВF1、SCD，其 中FASN和SCD为差异极显著基因。FASN与SCD、SREВF1、PGK1均有互作关系。

表1 HF 组和LF 组基因表达差异显著的基因

2.3 GO 和KEGG 分析 对差异基因进行生物过程的GO 分析并作层次图（图5），富集在新陈代谢过程的显著基因最多，按照层次依次减少，最终富集在脂肪酸代谢、糖酵解和双羧酸代谢过程。P值最小的为酒精代谢和小分子代谢。差异基因FASN、SCD、HMGCS1、PTEN和APOA1参与脂肪酸代谢过程，其中FSAN和SCD是差异极显著基因。由显著基因的KEGG 分析（图6）可以看出，参与基因最多的通路为代谢调节通路（01100），CYP2C45参与了此通路。另外显著基因参与了胰岛素信号传导、丙酮酸代谢、碳代谢、脂肪酸代谢通路和过氧化物酶体增殖剂激活受体信号传导通路。参与脂肪代谢调节（01212）的4 个基因（图7）中，FASN和SCD为表达差异极显著基因。

2.4 共同基因分析 将本研究筛选的表达差异显著基因与发表的脂肪组织差异表达基因[10-11]进行韦恩图解分析（图8），发现FASN、SCD和FADS2基因为共同差异基因，其中FASN和SCD为本研究筛选的差异极显著基因。此外CYP2C45基因在本研究和Resnyk 等[10]的研究中均为表达差异基因。由图9 可见，FASN、SCD和FADS2基因之间均存在互作。

3 讨论

本研究在HF 组和LF 组的鸡肝脏中共筛选出26个表达差异显著的基因，CYP2C45、FASN、SCD和FADS2是比较重要的关键基因。CYP2C45基因是差异表达最为显著的基因，CYP2C45的互作基因为FASN，FASN和SCD不仅是本研究筛选的表达差异极显著基因，也是互作网络计算出来的核心基因。GO 分析和KEGG 分析发现FASN和SCD参与了脂肪代谢调节。FADS2和FASN、SCD是与维恩图解分析的相关基因，FADS2还参与了脂肪代谢通路（01212）的调节。

CYP2C45是细胞色素P450（CYP450）家族的一员，是内质网上混合功能氧化酶系统末端氧化酶，CYP酶在内源性底物（如甾体激素、前列腺素和胆汁酸）的生物合成中起着关键作用，CYP2C在不饱和脂肪酸的调节中具有重要作用[12]。而CYP2C45是CYP2C家族成员之一，主要在动物肝脏和小肠中表达，是鸡的肝脏中表达最丰富的亚型，研究发现中填饲组鹅CYP2C45表达量与对照组差异显著，且CYP2C45参与调节丙酮酸激酶和花生四烯酸脂肪氧化酶的表达[13]。本研究也发现CYP2C45在低脂组鸡中表达量较高，说明该基因的表达可能与脂肪的降解有关。FASN为脂肪酸合成酶的多酶复合体，它能够识别底物并最终合成16 个碳原子的饱和脂肪酸链，并在此基础上合成其他脂肪酸[14]。该基因广泛存在于动物的各个组织中，但在鸡的肝脏组织中表达量最丰富。研究发现脂肪沉积较少的品种中，肝脏组织中FASN的表达量较少[15]。SCD是硬脂酰辅酶 A 去饱和酶，为脂肪代谢过程中的Δ9 去饱和酶，能够影响细胞膜的流动性[16]，参与鸡肝脏对脂肪代谢的调节[17]，维持血脂浓度平衡[9]。FADS2是脂肪代谢过程中Δ6-脂肪酸脱氢酶基因，该基因在不饱和脂肪酸的合成中具有关键的作用[18]，研究发现该基因能显著影响鸡的肌肉脂肪含量[19]。

在本研究筛选出的关键基因中，FASN是脂肪酸合成酶基因，SCD和FADS2为脂肪酸去饱和酶基因，CYP2C45基因参与去饱和酶的表达的调节[13]。不饱和脂肪酸是脂肪酸合成后在不同的去饱和酶作用下生成的。4 个关键基因均与不饱和脂肪酸合成有关。不饱和脂肪酸能提高脂蛋白脂酶、LDL 受体的活性等，可以加速脂肪代谢和抑制脂肪合成[20]。

差异基因的GO 分析发现显著基因参与了糖酵解和双羧酸代谢等过程，KEGG 分析发现差异基因参与胰岛素信号传导、丙酮酸代谢等途径，这些均属于糖代谢的一部分。糖代谢途径是脂肪酸合成所需要的炭骨架来源，为脂肪的合成提供了甘油骨架、乙酰辅酶A、还原氢以及能量，脂代谢和糖代谢是密不可分的。

4 结论

本研究共筛选出肝脏中26 个表达差异基因与鸡的脂肪沉积有关，关键基因CYP2C45、FASN、SCD、FADS2均与不饱和脂肪酸的合成有关。此外，糖代谢可能参与脂肪代谢的调节。