郑小菲，朱娟芳，王素苹，喻琼琼，甘抗

(郑州大学第一附属医院 口腔医学中心，河南 郑州 450052)

他克莫司(FK506)是从链霉菌属中分离的一种发酵产物，作为一种强力的新型免疫抑制剂，目前已成为临床中器官移植患者最常用的免疫抑制剂之一[1]。他克莫司的免疫作用机制是通过与细胞内亲免疫素FK506结合蛋白(FKBP12)结合，形成FK506/FKBP12复合体，该复合体抑制钙调磷酸酶活性[2-3]，抑制白细胞介素2、肿瘤坏死因子α等细胞因子的分泌，从而阻止T淋巴细胞的活化和增殖，发挥免疫抑制效应[2,4]。虽然他克莫司与传统的免疫抑制剂环孢菌素A的作用机制相似，但是他克莫司的免疫抑制效应更强大，是环孢菌素A的10～100倍[5]。另外，他克莫司在引起高血压和高脂血症方面的副作用相对更小，对肾功能无影响[6]，且肝毒性较环孢菌素A低[7]。鉴于以上优势，他克莫司已逐渐取代环孢菌素A，成为肝、肾等器官移植患者的首选免疫抑制药物。移植后排斥反应对传统免疫抑制方案耐药者也可选用该药物。

本研究拟通过连续2周给予他克莫司建立免疫抑制状态的小鼠模型，并通过检测小鼠的胸腺和脾脏指数、外周血T淋巴细胞亚群比例及脾脏T细胞增殖进行模型鉴定。本研究旨在探索采用他克莫司建立免疫抑制小鼠模型的方法和效果，从而为采用免疫抑制模型的相关动物研究奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验器材 电子天平(Sartorius，美国)，微量移液枪(Eppendorf，德国)，离心机(Thermo scientific，美国)，流式细胞仪(Cytomic FC500，BECKMAN，美国)，光学显微镜(Nikon Eclipse E600，日本)，Image J软件(NIH，美国)。

1.1.2实验试剂 他克莫司(Sigma，美国)，生理盐水，乙醇，氯胺酮，甲苯噻嗪，PBS缓冲液，FITC-CD4单克隆抗体(eBioscience，美国)，PE-CD8单克隆抗体(eBioscience，美国)，红细胞裂解液(biosharp，中国)，40 g·L-1多聚甲醛，双蒸水。

1.2 实验动物与分组10周龄雄性C57BL/6小鼠购于郑州大学实验动物中心，于SPF级动物房饲养，动物质量合格。本研究经郑州大学生命科学伦理审查委员会审批通过。根据啮齿类动物的标准饲养条件饲养实验动物，实验动物可自由摄食和饮水，饲养环境温度为(23±2)℃，湿度55%。每12 h交替进行白昼和黑夜变换。

1.3 模型建立他克莫司水溶性差，极易溶于乙醇、三氯甲烷、二甲基亚砜等有机溶剂。采用乙醇将他克莫司溶解至储存浓度，使用前用生理盐水稀释至注射浓度(0.1 g·L-1)。将实验所用小鼠在适应性饲养1周后随机分为对照组和模型组。对模型组小鼠腹腔内注射他克莫司(1 mg·kg-1·d-1)，对照组小鼠腹腔内注射等剂量的生理盐水。连续注射2周后，检测相关指标评估小鼠的免疫状态。

1.4 检测指标

1.4.1小鼠器官质量指数的测定 连续给药2周后，称小鼠质量，腹腔内注射过量麻醉药处死动物，解剖后完整取出脾脏和胸腺，滤纸吸去表面残血，于十万分之一电子天平上称质量。器官质量与小鼠质量之比为器官指数。

1.4.2外周血T细胞亚群百分率检测 小鼠行腹腔麻醉(氯胺酮0.1 mg·g-1加入甲苯噻嗪0.01 mg·g-1)后，摘除小鼠眼球，立即取血100 μL，收集于肝素抗凝管中；加入2 μL FITC-CD4抗体和2.5 μL PE-CD8抗体混合，室温下避光孵育15 min；加入600 μL红细胞裂解液，裂解红细胞2 min，离心(500×g，5 min)，加入1 mL PBS洗涤1次，弃上清液；用500 μL PBS重悬细胞，立即上流细胞仪检测，分析外周血中CD4+/CD8+T细胞比例。

1.4.3脾脏T细胞增殖实验 选用刀豆蛋白A(ConA)作为促有丝分裂素，MTT法检测小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖能力。具体步骤：研磨脾脏，溶解于RPMI-1640培养液中，获得细胞悬液，将组织通过细网细胞过滤器；红细胞裂解液去除红细胞，清洗，离心，溶于含10%FBS的RPMI-1640培养液中；细胞计数，吸取100 μL细胞密度为1×10-7mL-1细胞溶胶接种于96孔培养板中，加入ConA(100 μL，5 mg·L-1)，对照孔不加ConA，培养48 h；加入MTT试剂(20 μL，5 g·L-1)，继续培养4 h；弃去培养液，加入150 μL DMSO，用酶标仪测定波长570 nm处OD值。ODConA与OD对照孔之比为增殖指数。

1.5 统计学分析采用SPSS 22.0软件处理数据，计量资料以均数±标准误表示，采用两独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物大体观察给药2周后，模型组小鼠开始出现精神萎靡，喜静少动，毛色晦暗。模型组小鼠质量为(21.44±0.97)g，对照组小鼠质量为(18.97±0.83)g，差异无统计学意义(P<0.05)。

2.2 小鼠器官指数对照组和模型组小鼠的脾脏指数和胸腺指数见表1。模型组小鼠在他克莫司作用下器官指数降低，与对照组小鼠相比，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 他克莫司对小鼠质量和器官指数的影响

2.3 外周血中CD4+/CD8+T细胞的流式分析流式分析结果显示，给予他克莫司2周后，对照组小鼠的CD4+/CD8+T淋巴细胞的比例为3.24±0.28，模型组小鼠的细胞比例为1.67±0.39。与对照组小鼠相比，模型组小鼠外周血中的CD4+/CD8+T细胞亚群比例降低(P<0.05)。

2.4 脾脏T细胞增殖能力的检测MTT结果显示，模型组小鼠脾脏T细胞的增殖指数为2.06±0.15，低于对照组小鼠的T细胞增殖指数(5.25±0.25)(P<0.05)。

3 讨论

在疾病研究过程中组织工程研究领域，构建动物模型是一种较为普遍的实验手段。临床应用前的动物研究选用的动物模型有犬、猪、兔和大鼠等动物。根据文献内容发现，随着动物个体的增大，样本量呈现明显的下降趋势，难以保证实验研究所需的样本数[8]。本研究选用小鼠作为动物模型，具备许多明显的优点：(1)小鼠来源方便，可以保证实验研究的动物个数；(2)小鼠质量轻，实验所需的药物剂量小。他克莫司注射剂量(1 mg·kg-1·d-1)的选择是基于先前的文献报道[9]。通过腹腔注射给药可以避免口服给药所带来的操作困难、实际服用药量的不确定性和多样性[10]。

脾脏和胸腺是机体重要的免疫器官。脾脏是机体最大的免疫器官，占全身淋巴组织总量的25%，是T、B淋巴细胞接受抗原刺激后增殖和发生特异性免疫应答的场所；胸腺主要介导细胞免疫反应，是T细胞分化成熟的重要场所。因此，脾脏和胸腺的相对质量与免疫功能的强弱有着密切关系[11]。免疫器官指数的分析结果表明，相比于对照组小鼠，给予他克莫司2周后模型组小鼠的脾脏指数和胸腺指数均显著降低。

T细胞增殖是机体针对抗原刺激产生免疫应答的重要过程，能够反映机体的细胞免疫效应。T细胞包含CD4+和CD8+亚群，各亚群及CD4+/CD8+T细胞比例是评价免疫状态的一个重要指标[12]。该比值降低标志着机体免疫功能的减弱[13]。流式细胞术有精确、快速、灵敏等优点，且具有定性和定量分析的特点，被认为是血液中淋巴细胞表型分析的标准方法。此研究利用流式细胞仪分析外周血中CD4+/CD8+T细胞比例，通过MTT法检测T细胞增殖。结果表明，他克莫司作用下的模型组小鼠体内CD4+/CD8+T细胞比例降低，T细胞增殖能力减弱。

本实验通过比较两组动物的免疫器官指数、T细胞亚群比例、T细胞增殖评估小鼠的免疫状态，连续2周注射药物他克莫司成功建立了免疫抑制的小鼠模型。该研究结果可以为采用免疫抑制动物模型的相关研究提供实验基础。