吴 丹，刘 佳，陈 丹

(四川省广安市人民医院，四川 广安 638500)

糖尿病性心肌病是糖尿病患者的主要并发症，是患者长期高血糖所导致的特异性心肌病变[1]。其发病机制是复杂和多因素的，包括氧化应激增加、钙处理受损、肾素-血管紧张素系统上调、底物代谢改变、线粒体功能障碍[2-3]。研究表明，咪达唑仑对缺氧/复氧诱导的新生大鼠心肌细胞凋亡具有抑制作用[4]，可以改善大鼠心肌氧化应激，保护心肌免受缺血再灌注损伤[5]。在大鼠心肌缺血再灌注损伤的模型中，咪达唑仑联合右美托咪定可以提高蛋白激酶B(Protein kinase B，AKT)的磷酸化水平，起到心肌保护作用[6]。然而，咪达唑仑是否可以减轻糖尿病性心肌病中心肌细胞的凋亡和氧化应激损伤尚不清楚。磷酸肌醇3激酶(Phospoinositide 3-kinase，PI3K)/AKT信号通路在调节细胞增殖和凋亡中起关键作用[7]。PI3K/AKT信号通路的激活已被证实参与了针对高血糖诱导的心脏损伤的保护[8-9]。本实验探讨咪达唑仑对高糖诱导心肌细胞H9C2损伤的影响及PI3K/AKT信号通路在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 心肌细胞H9C2(中科院上海细胞库)；胎牛血清(FBS)、DMEM培养基(美国Gibco公司)；咪达唑仑(江苏恩华药业有限公司)；PI3K/AKT特异性抑制剂LY294002(美国Sigma-Aldrich公司)；细胞计数试剂盒(CCK-8)(日本Dojindo公司)；辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(上海康成生物公司)；Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)细胞凋亡试剂盒、增强化学发光液(ECL)(南京凯基公司)；SOD、MAD检测试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)；PVDF膜(美国Bio-Rad公司)；兔抗PI3K单克隆抗体、兔抗磷酸化PI3K(p-PI3K)单克隆抗体、兔抗AKT单克隆抗体、兔抗磷酸化AKT(phospho-AKT，p-AKT)单克隆抗体、兔抗Caspase-3单克隆抗体、兔抗GAPDH单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)。

1.2 细胞培养 将心肌细胞H9C2在添加10% FBS的DMEM培养基中，在5% CO2、95%空气和37℃培养，每2天换液1次。

1.3 实验分组与处理 将细胞分为对照组(给予5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(给予35 mmol/L葡萄糖[10])、高糖+低剂量药物组(给予5 ng/mL咪达唑仑和35 mmol/L葡萄糖)、高糖+中剂量药物组(给予10 ng/mL咪达唑仑和35 mmol/L葡萄糖)、高糖+高剂量药物组(给予20 ng/mL咪达唑仑和35 mmol/L葡萄糖)、高糖+LY294002组(给予35 mmol/L葡萄糖和10 μmol/L LY294002[11])、高糖+高剂量药物+LY294002组(给予20 ng/mL咪达唑仑、LY294002和35 mmol/L葡萄糖)。各处理组孵育24 h后，收获细胞以检查细胞活性、细胞凋亡、氧化应激和蛋白表达。

1.4 CCK-8检测细胞活性 将心肌细胞H9C2以1×104个/mL的密度接种在96孔板中，在37℃下孵育，并使用CCK-8评估细胞活性。根据1.3中进行指定的处理后，将10 μL CCK-8溶液添加到每孔中，然后将96孔板在培养箱中培养2 h。使用酶标仪测定450 nm处的吸光度(OD)值，其平均值用以表示细胞活性。每组3个复孔，实验重复3次。

1.5 流式细胞术评估细胞凋亡 心肌细胞H9C2经过指定的处理后，收集1×105个，遵循凋亡检测试剂盒的步骤，加入500 μL Binding Buffer重悬，之后加入5 μL Annexin V-FITC混匀和5 μL碘化丙啶混匀，室温黑暗中反应，15 min后FACS Calibur流式细胞仪评估细胞凋亡。

1.6 Western blot检测Caspase3、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表达 经过指定的处理后，收获心肌细胞H9C2，并在4℃下用细胞裂解液裂解30 min，定量后通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白(30 μg)进行分离，并转移至PVDF膜。在室温下，用5%的脱脂牛奶将膜封闭60 min，然后与抗Caspase3(1∶1 000稀释)、抗p-PI3K(1∶1 000稀释)、抗PI3K(1∶1 000稀释)、抗p-AKT(1∶1 000稀释)、抗AKT(1∶1 000稀释)、抗GAPDH(1∶2 000稀释)一抗孵育过夜。与HRP偶联的山羊抗兔二抗(1∶3 000稀释)一起孵育，在室温下放置1.5 h。使用ELC可视化反应信号，之后扫描、ImageJ软件进行分析。以GAPDH为对照，测定Caspase3、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表达。

1.7 比色法测定SOD活性和MDA含量 依照SOD、MDA试剂盒的检测步骤，心肌细胞H9C2经过指定的处理后，收获上清液，进行SOD活性和MDA含量测定。

2 结果

2.1 咪达唑仑对高糖诱导心肌细胞损伤中凋亡及细胞活性的影响 CCK-8、流式细胞术和Western blot检测结果显示(见图1和表1)，与对照组相比，高糖组心肌细胞H9C2的OD值降低，细胞凋亡率增加，Caspase3蛋白表达量升高，差异均有统计学意义(P均<0.05)。高糖+低剂量药物组的细胞活性、凋亡率和Caspase3蛋白表达相比于高糖组，差异无统计学意义(P>0.05)。与高糖组或高糖+低剂量药物组相比，高糖+中、高剂量药物组心肌细胞H9C2的细胞活性逐渐增强，凋亡率逐渐减弱，Caspase3蛋白表达水平降低，差异均有统计学意义(P均<0.05)。与高糖+中剂量药物组相比，高糖+高剂量药物组的心肌细胞H9C2活性升高，凋亡率降低，Caspase3蛋白表达量减少，差异均有统计学意义(P均<0.05)。

A：对照组；B：高糖组；C：高糖+低剂量药物组；D：高糖+中剂量药物组；E：高糖+高剂量药物组。图1 咪达唑仑对高糖诱导心肌细胞损伤中凋亡及Caspase3蛋白表达的影响

表1 咪达唑仑对高糖诱导心肌细胞的活性、凋亡及Caspase3蛋白表达的影响

2.2 咪达唑仑对高糖诱导心肌细胞损伤中SOD、MDA水平变化的影响 与对照组相比，高糖组心肌细胞H9C2的SOD活性降低，MDA含量升高，差异均有统计学意义(P均<0.05)。高糖组与高糖+低剂量药物组的细胞相比，SOD活性和MDA含量的差异无统计学意义(P>0.05)。与高糖组或高糖+低剂量药物组相比，高糖+中、高剂量药物组心肌细胞H9C2的SOD活性逐渐增强，MDA含量减弱，差异均有统计学意义(P均<0.05)。与高糖+中剂量药物组相比，高糖+高剂量药物组的心肌细胞SOD活性升高，MDA含量减少，差异均有统计学意义(P均<0.05，见表2)。

表2 咪达唑仑对高糖诱导心肌细胞损伤中SOD、MDA水平变化的影响

2.3 咪达唑仑对高糖诱导心肌细胞损伤中PI3K/AKT的影响 与对照组相比，高糖组心肌细胞H9C2的p-PI3K和p-AKT蛋白表达量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。高糖+低剂量药物组内p-PI3K和p-AKT蛋白表达相比于高糖组，差异无统计学意义(P>0.05)。与高糖组或高糖+低剂量药物组相比，高糖+中、高剂量药物组心肌细胞H9C2的p-PI3K和p-AKT蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与高糖+中剂量药物组相比，高糖+高剂量药物组心肌细胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表达量增强，差异有统计学意义(P<0.05)。而5组细胞之间的PI3K和AKT蛋白表达水平差异均无统计学意义(P均>0.05，见图2和表3)。

A：对照组；B：高糖组；C：高糖+低剂量药物组；D：高糖+中剂量药物组；E：高糖+高剂量药物组。图2 p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白的表达

表3 咪达唑仑对高糖诱导心肌细胞损伤中PI3K/AKT的影响

2.4 LY294002减弱咪达唑仑对高糖诱导心肌细胞凋亡及细胞活性的影响 CCK-8、流式细胞术和Western blot检测结果显示(见图3～5)，与高糖组相比，高糖+LY294002组心肌细胞H9C2的OD值降低、细胞凋亡率增加、Caspase3蛋白表达水平升高，p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平降低；但高糖+高剂量药物组提高心肌细胞的OD值，降低细胞凋亡率，并减少Caspase3蛋白表达量，增加p-PI3K、p-AKT蛋白表达量，差异均有统计学意义(P均<0.05)。心肌细胞H9C2使用20 ng/mL剂量的咪达唑仑和PI3K/AKT特异性抑制剂LY294002处理后，与高糖+高剂量药物组相比，高糖+高剂量药物+LY294002组细胞的OD值减少、细胞凋亡率增强、Caspase3蛋白表达量升高，p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平降低，差异均有统计学意义(P均<0.05)。4组细胞PI3K、AKT蛋白表达水平差异无统计学意义。

A：高糖组；B：高糖+LY294002；C：高糖+高剂量药物组；D：高糖+高剂量药物组+LY294002。图3 LY294002对咪达唑仑作用的高糖诱导心肌细胞损伤凋亡及相应蛋白表达的影响

表4 LY294002减弱咪达唑仑对高糖诱导心肌细胞损伤凋亡及细胞活性的影响

表5 PI3K/AKT信号通路蛋白的表达

2.5 LY294002减弱咪达唑仑对高糖诱导心肌细胞损伤中SOD、MDA的影响 与高糖组相比，高糖+LY294002组心肌细胞H9C2的SOD活性降低，MDA含量升高；而高糖+高剂量药物组心肌细胞的SOD活性增强，MDA含量减弱，差异均有统计学意义(P均<0.05)。心肌细胞H9C2使用20 ng/mL剂量的咪达唑仑和PI3K/AKT特异性抑制剂LY294002处理后，相比于高糖+高剂量药物组，高糖+高剂量药物组+LY294002组降低细胞的SOD活性，提高MDA含量，差异均有统计学意义(P均<0.05，见表6)。

表6 高糖诱导心肌细胞损伤中SOD、MDA含量的测定

3 讨论

本项研究中，使用体外模型评估了咪达唑仑对心肌细胞高糖损伤的保护作用，即将心肌细胞H9C2暴露于高糖，诱导的细胞损伤模型，结果证明了咪达唑仑对高糖损伤的心肌细胞保护能力，主要表现为细胞活性的显著提高，细胞凋亡的降低，SOD活性的增强和MDA含量的抑制。在对机制的初步探索中，发现咪达唑仑可能通过激活PI3K/AKT信号通路对暴露于高糖的H9C2细胞产生保护作用。

长期高血糖和高血糖引起的氧化应激是糖尿病性心肌病发展的主要原因[12]。此外，心脏氧化应激与细胞死亡和心肌纤维化有关，将导致潜在的致命性心脏事件。MDA是细胞脂质过氧化的产物，SOD是抗氧化防御系统中重要的抗氧化酶，二者可以反映细胞的氧化应激损伤程度。既往研究发现，细胞凋亡在糖尿病性心肌病的进展中起重要作用[13]。Caspase-3是一种重要的凋亡执行蛋白酶，已成为细胞凋亡研究的重点[14]。本研究中，高糖会导致心肌细胞H9C2活性抑制、凋亡增加和氧化损伤，表明高糖诱导心肌细胞H9C2损伤，且这种损伤可能与氧化应激和细胞凋亡紧密相关。

苯二氮卓衍生物咪达唑仑是用于镇静的最广泛使用的麻醉剂，Lee等[15]已证明咪达唑仑对糖尿病小鼠视网膜中高血糖引起的血管渗漏具有预防作用，可以防止活性氧(ROS)生成。然而其在糖尿病心肌病中的作用尚未明了。本项研究中发现，10、20 ng/mL剂量的咪达唑仑干预后，高糖诱导的心肌细胞H9C2的活性升高，细胞凋亡和Caspase3蛋白表达降低，抗氧化酶SOD活性增强且脂质过氧化产物MDA的含量减少，这些结果表明咪达唑仑具有改善心肌细胞损伤的功能，它可能通过促进细胞活性，减轻氧化应激，抑制细胞凋亡来保护高糖培养的心肌细胞H9C2损伤。并且，20 ng/mL与10 ng/mL剂量的咪达唑仑的作用结果差异显著，因此后续选择20 ng/mL剂量进一步研究。

PI3K/AKT信号传导途径是调节细胞转录、代谢、存活和炎症的关键。PI3K是血糖调节的关键协调器，提示其可能参与糖尿病的发生发展[16]。PI3K产生脂质第二信使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸酯(Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphophate，PIP3)，从而导致AKT磷酸化。AKT在调节细胞存活与凋亡之间的平衡方面具有重要意义。疏水基序和激活环上的AKT磷酸化可激活激酶并促进细胞存活[17]。高糖可以抑制PI3K/AKT途径，而激活PI3K/AKT信号通路有利于防止高糖诱导的心肌细胞凋亡[18]。有研究表明，咪达唑仑可以浓度依赖性的诱导B35细胞中AKT的磷酸化，并降低葡萄糖氧化酶(GOX)诱导的B35神经母细胞瘤细胞凋亡，保护细胞免受诱导的ROS损伤[19]。为了确定咪达唑仑如何调节PI3K/AKT通路并进一步调节心肌细胞损伤，采用Western blot检测PI3K/AKT通路蛋白水平，发现高糖刺激后PI3K/AKT途径的磷酸化水平降低，这与以前的研究一致[20]。值得注意的是，当用高糖刺激心肌细胞H9C2时，10、20 ng/mL剂量的咪达唑仑干预后，心肌细胞H9C2中p-PI3K和p-AKT蛋白表达水平显著升高，而PI3K和AKT蛋白表达水平无明显变化，表明咪达唑仑可以提高PI3K/AKT信号通路活性。证明咪达唑仑在糖尿病性心肌病中发挥作用的潜在机理与PI3K/AKT信号传导途径有关。当在心肌细胞H9C2使用PI3K/AKT信号通路特异性抑制剂LY294002时，与高糖组相比，LY294002处理显著减少高糖诱导的心肌细胞H9C2的细胞活性、SOD活性，明显增加细胞凋亡率、Caspase3蛋白表达量、MDA含量。并且，咪达唑仑对高糖诱导的心肌细胞活性的促进作用，以及对细胞凋亡和氧化应激的抑制作用被LY294002所减弱。综合这些结果，说明咪达唑仑通过激活PI3K/AKT信号通路来保护心肌细胞免受高糖损伤。

综上所述，10、20 ng/mL剂量的咪达唑仑可以提高高糖诱导的心肌细胞H9C2的细胞活性，减轻氧化应激和抑制细胞凋亡，其保护心肌细胞免受高糖损伤的机制与激活PI3K/AKT信号通路有关。