黎维维，雷 杰，马先奎，欧阳陈琳，王 刚

(遵义医科大学 药学院，贵州 遵义 563099)

卷柏属(Selaginella)植物为多年生草本植物，药用干燥全草[1]，世界各地分布着700种卷柏属植物，中国约有60～70种[2]，主要分布在长江以南地区，在贵州、四川、云南等地都有分布，民间常用的卷柏属植物有兖州卷柏、中华卷柏、细叶卷柏、小卷柏、垫状卷柏等[3-4]，卷柏属植物中的化学成分包括挥发油、黄酮类、甾类、生物碱等化合物[4-6]，具有抗肿瘤、抗炎[7]、抗氧化[8-9]、抗突变[10]等作用。顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术(HS-SPME/GC-MS)是研究挥发性成分的重要方法[11]。与传统方法相比，HS-SPME使用涂覆有固定相的熔融石英纤维来实现对挥发性成分的直接吸附[12]。该技术的优点包括：集采样、提取和分析于一体，操作简便，缩短了分析时间；样品消耗低，灵敏度高[13]。因此HS-SPME/GC-MS结合使用对挥发物能够进行高效、灵敏和快速的分析。同时，基于NIST数据库搜索，该技术可以实现复杂样品系统中痕量挥发性成分的发现，例如倍半萜、单萜等活性成分。

由于卷柏属植物种类繁多，外形特征相似，仅靠显微鉴别等技术无法区别[14]，需要建立一个科学的质量评价体系。虽然已有学者通过GC-MS技术分析了部分卷柏属植物的挥发性成分，但挥发性成分主要是饱和脂肪烃和饱和脂肪酸，无明显差异[15]。鉴于卷柏属植物显著的药理活性，有必要深入研究该属植物的化学成分。[16]

本实验利用HS-SPME与GC-MS联用技术萃取分析兖州卷柏Selaginellainvolvingns(Si)、细叶卷柏Selaginellalabordei(Sl)、垫状卷柏Selaginellapulvinata(Sp) 挥发性成分，建立一种快速、无溶剂萃取卷柏属植物挥发性成分的方法，并利用GC-MS对3种卷柏属植物进行比较分析。首先，通过单因素试验研究不同参数(萃取头类型、萃取时间、萃取温度)对3种样品挥发性成分的影响，以获得最佳萃取条件。采用优化后的方法分析评价3种植物挥发性成分，将获得的数据运用主成分分析(PCA)建立不同卷柏属植物评价体系。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 Agilent 6890/5973型气相色谱-质谱联用仪(美国安捷伦公司)；手动固相微萃取装置、SPME手柄、100 μm PD萃取纤维头、75 μm CAR/PDMS萃取纤维头、65 μm PDMS/DVB萃取纤维头、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纤维头(美国supleco公司)；加热器(北京康林科技有限公司)；JJY1002型电子天平(上海浦春计量仪器有限公司)；DEY-400摇摆式高速万能粉碎机(温岭市林大机有限公司)。

兖州卷柏、细叶卷柏、垫状卷柏采自贵州省遵义市四面山，秋季采收，3种卷柏属植物经遵义医科大学张玉金教授鉴定为Selaginellainvolvingns,Selaginellalabordei,Selaginellapulvinata。

1.2 实验方法

1.2.1 实验样品制备 兖州卷柏、细叶卷柏、垫状卷柏全草在室温25 ℃下风干后，经过粉碎机粉碎，过60目筛，密封保存备用。

1.2.2 实验预处理 在每次进样之前都需要对萃取头净化处理，于250 ℃加热5 min后再使用。

1.2.3 顶空固相微萃取条件 分别精密称取3种待测样品粉末1.00 g放入15 mL萃取瓶中，于70 ℃水浴条件下预热30 min，将不同涂层的萃取头对样品中挥发性成分吸附一定的时间，然后插入气相色谱质谱联用仪进样口中吸附5 min进行检测分析。

1.2.4 气相色谱与质谱条件 色谱条件：采用6890N-5973气相色谱质谱联用仪、 HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度250 ℃，起始温度50 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升温至130 ℃；然后以7 ℃/min升温至200 ℃，保持5 min，气化室温度为250 ℃，分流进样，分流比为10∶1，流速为0.8 mL/min，载气为氦气，流量1 mL/min。 质谱条件：电子轰击电离(EI)，离子源温度230 ℃，接口温度为250 ℃，溶剂延迟5 min，质量扫描范围m/z 50-550，电子能量70 eV。

1.2.5 重复性实验[17]按“1.2.3及1.2.4”项下条件操作，进行进样分析，在相同积分条件下，以3种卷柏属植物挥发性成分的总峰面积为考察指标，计算其RSD均<2.0%，说明该方法重复性好，所选萃取条件精确，适合卷柏属植物挥发性成分的分析。

1.2.6 主成分分析[18]采用SPSS18.0软件对挥发油成分进行因子分析，根据相关系数列出相关矩阵，求出特征根及相应的特征变量。

1.2.7 HS-SPME条件的优化 研究不同类型的萃取头(30/50 μm PDMS、75 μm PDMS/CAR、100 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB)、萃取时间(5、10、15、20、25 min)、萃取温度(80、90、100、110、120 ℃)对兖州卷柏、细叶卷柏、垫状卷柏挥发性成分的提取效果，并优化研究条件。

2 结果

2.1 萃取条件的选择

2.1.1 萃取纤维头的选择 采用30/50 μm PDMS、75 μm CAR/PDMS、100 μm DVB/CAR/ PDMS、65 μm PDMS/DVB 4种不同纤维头对3种卷柏属植物挥发性成分的萃取效率进行比较，其余提取条件为:萃取时间20 min，萃取温度100 ℃。4种 SPME 萃取纤维头萃取不同种类化合物色谱图总峰面积见图1。使用 4 种不同 SPME 萃取纤维头检出的挥发性成分在种类和含量上有较大差异，采用 65 μm PDMS/DVB 萃取头检出的挥发性成分种类和数量较多，且挥发性成分色谱峰面积最大，确定65 μm PDMS/DVB萃取纤维头为最佳萃取纤维头。

图1 萃取纤维头对不同类型挥发性成分的影响

2.1.2 萃取时间的选择 选用65 μm PDMS/DVB萃取头，萃取温度为100 ℃条件下，对提取3种样品挥发性成分的萃取时间(5、10、15、20、25 min)作了评价(见图2)。当样品在萃取瓶中加热时，卷柏挥发性成分的总峰面积在0～20 min内持续增加，但随着萃取时间的增加，在20～25 min时间范围内3种卷柏属植物挥发性成分的总峰面积下降，可能是因为部分挥发性成分在长期加热条件下降解，由图2可知挥发性成分的最大峰面积平均为7.7×106，确定最佳萃取时间为20 min。

图2 萃取时间的选择

2.1.3 萃取温度的选择 研究不同萃取温度对3种卷柏属植物挥发性成分的影响，设置温度梯度(80、90、100、110、120 ℃)采用65 μm PDMS/DVB纤维头萃取样品20 min，如图3所示，当温度在80～100 ℃内，不同种类卷柏属植物的挥发性成分的含量均有明显增加。当温度在100～120 ℃时，挥发性成分的总峰面积显著降低。因此确定100 ℃作为最佳萃取温度。

图3 萃取温度的选择

2.2 3种卷柏属植物挥发性物质的分析 按照顶空固相微萃取条件和气相色谱-质谱条件，分析3种卷柏属植物的挥发性成分，经安捷伦化学工作站数据处理并用峰面积归一化法从总离子图中计算各组分相对质量分数，将所获得的光谱通过NIST数据库参考化合物数据相匹配，并结合相关文献，初步鉴定了85种化合物。各组分的相对含量用百分数表示，即峰面积与总峰面积之比，分析结果见图4和表2。

在最佳萃取条件下，3种卷柏属植物的总离子流图(TIC)如图4所示，对其挥发性成分进行分析后发现，3种卷柏属植物在挥发性物质的种类及相对含量上存在一定的差异，3种卷柏属植物中共鉴定出85种成分，兖州卷柏中共分离出37种峰，确定了其中的34种成分，占总挥发性成分的87.79%；细叶卷柏中共分离出40种峰，确定了其中的38种成分，占总挥发性成分的84.43%；垫状卷柏中共分离出50种峰，确定了其中的48种成分，占总挥发性成分的94.17%，得到的保留指数与文献报道一致，化合物的保留时间和保留指数在40 min之内呈线性相关。3种卷柏属植物中有4种共有成分，包括1-十三烯、石竹素、β-瑟林烯、(9E)-9-十八碳烯。

A:兖州卷柏(Si)；B:细叶卷柏(Sl)；C:垫状卷柏(Sp)。图4 3种卷柏属植物的总离子流图

结合表1和图5看出，被鉴定出的挥发性成分可分为12类，包括倍半萜21种、脂肪烃16种、醇类11种、酮类9种、单萜类4种、酯类5种、醛类6种、醚类5种、芳香族化合物4种、酚类2种、卤代烃1种、呋喃化合物1种。从测定结果可知，3种卷柏属植物在含量和种类上存在差异，例如细叶卷柏和垫状卷柏中倍半萜含量明显高于兖州卷柏，且细叶卷柏中的倍半萜含量最多；细叶卷柏和垫状卷柏中脂肪烃含量约为兖州卷柏的4倍；醇类含量在3种卷柏属植物中的分布差异较大，兖州卷柏中醇类含量分别是细叶卷柏的26倍和垫状卷柏的5倍；兖州卷柏醛类的含量分别是细叶卷柏的7倍和细叶卷柏的8倍。此外，细叶卷柏中不存在芳香族化合物，卤代烃是其特有成分；呋喃、单萜是垫状卷柏中的特有成分。

表1 3种不同卷柏属植物的挥发性成分比较

图5 3种卷柏属植物中挥发性成分的种类

倍半萜类(21)、醇类(11)、脂肪烃类(16)是3种卷柏属植物中的挥发性成分含量和种类较高的3种类型。倍半萜是所有挥发性成分中含量和种类均较多的物质，其主要成分包括反式石竹烯、白菖烯、异长叶烯、佛术烯、香树烯。其中垫状卷柏中的白菖烯是兖州卷柏的6倍，兖州卷柏中的佛术烯是垫状卷柏中的6倍、细叶卷柏中的香树烯是垫状卷柏的2倍；有趣的是在细叶卷柏中检出 (-)-Α-荜澄茄油烯、(+)-环苜蓿烯、异长叶烯、(-)-α-古芸烯、α-蒎烯、α-律草烯、花柏烯、α-姜黄烯，而其它两种卷柏属植物没有检测到(具体挥发性成分见表2)。

表2 3种卷柏属植物挥发性的成分及相对含量(%)

醇类物质在兖州卷柏中的含量较多，主要成分包括1-辛烯-3-醇、辛醇，其中1-辛烯-3-醇的含量是垫状卷柏的34倍，其含量超过总挥发性成分的1/3，较细叶卷柏和垫状卷柏中的醇类物质多，Gunaseelan等[19]发现芳樟醇可以预防小鼠皮肤急性紫外线B引起的增生、脂质过氧化和抗氧化损失，并可以进一步抑制小鼠皮肤中环氧合酶2和鸟氨酸脱羧酶的过表达，表明醇类物质具有一定的抗氧化作用。在我们的初步实验中发现卷柏属挥发性成分具有抑制肿瘤细胞增殖及清除自由基的作用，但还需进一步研究关于卷柏属植物具体成分的药理活性。

续表2

2.3 统计学分析

2.3.1 主成分分析 将3种卷柏的挥发性物质的含量导入SPSS18.0中，行表示分析的样品(9批卷柏样品)，在进行分析前需将数据进行均一化处理，主成分的特征值及方差贡献率是选择主成分的指标[20]，具体指标信息见表3。只有特征值为>1的不同样本的主成分(PCs)作为数据统计处理[21]。采用PCA对数据集进行分析，最终考虑采用PC1、PC2(见表3)，其主成分分析图见图6。

表3 主成分的特征值及贡献率

A：散点图；B：载荷图。图6 3种卷柏属植物挥发性成分主成分分析

2个主成分的载荷矩阵通过SPSS18.0软件处理可得到特征向量，即特征值>1的向量，3种卷柏属的主成分得分可通过Y1=FAC1-1-1*SQRT(λ1)(表3中λ1=48.34)，Y2=FAC2-2-1*SQRT(λ2) (表3中λ2=36.105)，表4中的Y1为3次重复实验中PC1的平均值，Y2为3次重复实验中PC2的平均值[22-23]。通过Y=0.57Y1+0.42Y2计算即可得每个样品的综合得分，各项系数为各主成分的贡献率，Y1、Y2为各成分的评分[24],见表4。

表4 样品主成分评分

详细分析各变量后，由图6可知，PC1的主要成分为壬醛、萜品油烯、芳樟醇、4-烯丙基苯甲醚、癸醛、β-环柠檬醛、茴香脑、黄樟素、甲基丁香酚、二氢猕猴桃内酯、十三烷、1-十三烯、1,1,6三甲基-1,2二氢萘、香叶基丙酮、十四烷、β-律草烯、反式石竹烯、(-)-α-古芸烯、抗氧剂264、α-毕橙茄醇、1-十六烯、正十六烷，其特征值都接近于1；PC2的主要成分为3-苯基丁-2-酮、4-羟基-3-叔丁基-苯甲醚、橙化基丙酮、正十五烷、β-瑟林烯、紫罗醇、S-(Z)-3,7,11-三甲基-1,6,10-十二烷三烯-3-醇、柏木脑；经过PCA分析，3种卷柏存在一些共有的成分，但是通过各因子的得分可知，垫状卷柏是3种卷柏属植物中综合评分较高的的植物，表明3种卷柏属植物的挥发性成分存在一定的差异。

3 讨论

对于挥发性成分的提取，以前的研究多采用水蒸气蒸馏法与超临界CO2萃取法，但是这种方法存在一定的不足之处，水蒸气蒸馏的提取时间较长，且高温使一些热不稳定的成分分解导致挥发性成分的损失，对环境也有一定的污染。而顶空固相微萃取方法能很好的解决这些问题，可作为一种新型通用的方法对挥发性成分进行提取。

通过实验结果推断3种卷柏属植物挥发性成分存在一定的差异，兖州卷柏中醇类物质含量最多，可作为兖州卷柏的特征性物质；细叶卷柏中不存在芳香族化合物，卤代烃是其特有成分，而其它2种卷柏属植物未有该类型化合物；呋喃及单萜化合物只存在于垫状卷柏；细叶卷柏和垫状卷柏中倍半萜类成分含量最高。对3种卷柏植物的挥发性成分进行主成分分析，发现3种卷柏属植物的特征性成分存在一定的差异，通过各因子的得分可知，垫状卷柏是3种卷柏植物评分较高的植物、其次是兖州卷柏、最后是细叶卷柏。采用HS-SPME-GC-MS技术分析探索卷柏属植物挥发性的痕量成分，分析3种卷柏属植物挥发性物质的差别，为卷柏属植物挥发性成分的评价与分析提供一个方向。同时该方法也适用于分析其它具有挥发性成分的植物，成为一种通用的新型的方法。首次成功运用HS-SPME/GC-MS法分析兖州卷柏、细叶卷柏、垫状卷柏中的挥发性物质。经过评估不同的萃取条件(萃取纤维头类型、萃取温度、萃取时间)，通过单因素实验,得到最优条件如下:65 μm PDMS/DVB纤维头、萃取时间20 min、萃取温度100 ℃。在此基础上，采用气相色谱-质谱联用技术对3种植物作了详细分析，共检出85种成分。此外，通过化主成分分析对不同挥发性化合物的分析数据进行了详细的评价，突出了3种卷柏植物不同挥发性成分的差异。因此，对3种卷柏属植物挥发性成分的深入研究，可以作为评价和区分不同种类卷柏属植物的有效工具。