王志刚，梁 亮，赵华才，管振锋，孙 羿，程永毅

(1.西安交通大学，陕西 西安 710000；2.陕西省人民医院 泌尿外科，陕西 西安 710000)

膀胱癌是男性泌尿系统发病率最高的肿瘤[1]，也是全世界常发肿瘤之一[2-3]，年新发病例约为549 000，膀胱癌相关年死亡病例约为199 900[4]，膀胱癌可以分为非肌肉浸润性肿瘤和肌肉浸润性肿瘤[5]，其中尤其以高级别浸润性膀胱癌为代表[6]，其恶性程度高，转移率高[7]，患者临床预后差[8]。虽然对膀胱癌的治疗以手术切除为主，辅以放化疗提高局部控制率及降低远处转移率，但是手术后患者容易复发[9]，使得术后总体生存率较差；而放化疗虽然可以取得较好的疗效，但其副作用较大。故寻找膀胱癌中突变的基因，并研究其具体的调控机制，尤其是针对膀胱癌浸润、转移的分子调控机制，对于膀胱癌的诊断、治疗及预后预测尤为重要。

G蛋白调节因子2 (G protein regulating factors 2，RGS2) 在细胞的空间分布广泛，可见于细胞膜、细胞质和细胞核。RGS2在肿瘤中的调控作用已经有较多报道，RGS2的异常表达可见于多种肿瘤，如卵巢癌[10]、结肠癌[11]和前列腺癌[12]等，并参与调控恶性肿瘤生物学行为。但是，RGS2与膀胱癌的关系却鲜有报道，故本研究旨在探究RGS2在膀胱癌发展进程中的调控作用及其机制，并进一步探索其与膀胱癌患者临床预后之间的关系，为膀胱癌诊断精准性的提高和治疗新靶点的选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与器材 3种人膀胱癌细胞系：RT4、T24及RT-112(细胞系均从北京协和细胞库购买)。含GFP的si-RGS2及其对照si-RGS2 control(si-RGS2 ctrl)质粒从山东维真公司设计且购买。RGS2和GAPDH引物从上海生工公司购买。培养基1640 及Matrigel基质胶购于Coring公司；胎牛血清购于Gibco公司；枪头、培养皿、移液枪及Transwell小室等购于普京康利公司；乙醇TBST、电泳液及电转液等购于中科科奥公司；氨苄青霉素、链霉素购于雷根生物公司；SNAIL (兔IgG)、 MMP2 (兔IgG)、MMP9 (兔IgG)、Vemintin (兔IgG))、PCNA(兔IgG)、P-ERK (兔IgG)和ERK(兔IgG)等抗体均购于CST公司；化学发光试剂盒、HRP标记山羊抗兔IgG二抗及抗鼠IgG二抗购于碧云天公司；0.22 μm孔径转印膜PVDF购于Millipore公司；Lipo2000 购于百灵克公司；CCK8试剂盒购于同仁公司；蛋白定量试剂盒及Trizol购于百诺威公司；荧光定量检测试剂盒及cDNA第一链合成预混试剂购于天根生化公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与转染 使用浓度为 10% 胎牛血清和 1%青链霉素双抗的1640细胞培养基，在 5% CO2的 37℃ 恒温孵箱中培养。

1.2.2 qRT-PCR(检测转染结果) 以Trizol法提取细胞总RNA，并对所提取的RNA进行逆转录，取2 μg RNA进行反应，条件如下：42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min。产物用于qRT-PCR检测，反应条件如下：95℃ 3 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，4 ℃保温，共计40个循环。每个样本设置3个复孔，并独立3次实验。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法进行计算。RGS2上游引物序列：AAGATTGGAAGACCCGTTTGAG; RGS2下游引物序列：GCAAGACCATATTTGCTGGCT。GAPDH上游引物序列：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT; GAPDH下游引物序列：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。上述引物均为人源性引物。

1.2.3 CCK-8检测培养细胞的增殖力 在96孔培养板中操作，将转染si-RGS2和si-RGS2 ctrl质粒后的人膀胱癌细胞按3 000个/孔的细胞量进行铺板，于0、24、48、72、96 h时间点用CCK8试剂进行光密度值测量。测量时先将孔板中的旧培养基吸去，并加入无血清培养基100 μL/孔，后以每孔10 μL添加CCK8试剂，将细胞培养孔板置于培养箱内孵育2 h后，使用酶标仪对450nm处的吸光度进行测量，每组设置6个复孔，分别铺5块板，每天使用一块板。

1.2.4 划痕实验 将转染si-RGS2和si-RGS2 ctrl质粒后的人膀胱癌细胞以一定密度接种到60 mm培养皿中，并放入培养箱培养24h后，待单层细胞密度应达到70%～80%后，用200 μL枪头轻轻地在单层培养细胞间进行划痕操作， PBS轻柔地清洗培养皿2～3次，用以除去划落的细胞，随后加入适量的无血清的培养基，并将细胞置于细胞培养箱中培养48 h，PBS清洗细胞培养皿2～3次以除去飘浮的细胞，然后于光学显微镜下进行拍照采图。

1.2.5 Transwell侵袭实验 提前将Matrigel胶于4 ℃冰箱过夜解冻，后以1∶10用无血清培养基进行稀释，并取100 μL稀释液加入Transwell上室中，使其均匀覆盖上室，并将其放入培养箱约4 h待其凝固。4 h后，将转染si-RGS2和si-RGS2 ctrl质粒后的细胞消化下来并用PBS反复轻柔洗涤3次，用无血清培养基重悬，调整密度为4×105个/mL，取100 μL接种于小室上层，在下层加入含10% FBS的培养基500 μL，放入培养箱中培养24 h，后用PBS清洗2次，并用棉棒在上室内轻轻转动，除去上室中未穿膜的细胞，并将已穿膜的细胞用95%的乙醇固定15 min后以0.3%的结晶紫溶液进行细胞染色15～20 min，用PBS轻柔清洗后进行风干。将小室放于显微镜下观察并拍照采图，在上下左右中间等位置进行计数。

1.2.6 Western blot检测 RGS2、PCNA、Vemintin、SNAIL、MMP2、MMP9、ERK和P-ERK等蛋白在T24细胞里的表达用Western blot方法进行检测。细胞转染si-RGS2后培养48 h，加入含蛋白酶抑制剂的强效RIPA buffer裂解细胞，离心(转速及时间)取上清，BCA试剂盒进行总蛋白定量。各组取30 μg蛋白总量SDS-PAGE凝胶孔中，以恒压80 V、30 min，120 V、60～80 min条件电泳，转移至PVDF膜上，随后按照不同的蛋白分子大小进行裁剪，后于室温用10%的脱脂牛奶封闭1～2 h，一抗过夜4℃ 孵育，二抗常温孵育2 h后，根据ECL化学发光试剂盒说明书对PVDF膜上的蛋白印迹进行曝光。 一抗稀释比例如下：SNAIL (1∶1 000),MMP2 (1∶1 000),MMP9 (1∶1 000),Vemintin (1∶1 000),PCNA (1∶1 000),P-ERK (1∶2 000) 和ERK (1∶1 000)。二抗的稀释比例如下：辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG (1∶3 000)，辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG (1∶3 000)。内参为GAPDH (1∶10 000)。相对灰度=目的条带灰度值/内参灰度值×100%。

1.2.7 RGS2小干扰RNA及转染 于转染操作的前24 h，将生长状态良好铺板至60 mm培养皿中，使其密度约为50%。次日进行细胞转染，首先将培养皿中的含10% FBS培养基吸去，并用PBS轻柔洗涤后，添加1.2 mL无血清培养基，使其没过细胞。使用Lipo2 000进行细胞转染，取灭菌1.5 mL EP管，加入141 μL无血清DMEM，并加入9 μL Lipo2 000，轻柔吹打均匀后室温孵育5 min；另取一灭菌1.5 mL EP管，加入4 μg质粒，用无血清DMEM将其此体系扩至150 μL，轻柔吹打混匀，室温孵育5 min；将上述混合液混匀，常温孵育20 min，后将所混合液加入含1.2 mL无血清培养基中，使体系摇晃均匀，并置于恒温培养箱中进行培养；6 h后将无血清培养基更换为含10% FBS的完全培养基，继续培养48 h后可以进行敲减效率的验证。 转染后培养的细胞分为对照组(si-RGS2 ctrl)和RGS2敲减组(si-RGS2)。

1.3 生物信息学分析 利用公开数据库对RGS2在人膀胱癌中的表达进行分析，并做生存曲线分析，以验证RGS2 是否与患者的临床预后相关。涉及的数据库有Oncomine，GEPIA和UALCAN，具体网址如下：ONCOMINE database: https://www.oncomine.org/；GEPIA database: http://gepia.cancer-pku.cn/index.html；Ualcan database: http://ualcan.path.uab.edu/。

2 结果

2.1 si-RGS2对人膀胱癌细胞系中RGS2的 mRNA及蛋白表达水平的影响 在光学显微镜下，用蓝光激发GFP，可以看到转染的细胞均表达数量较多的GFP，说明转染效率较高。与对照组相比，si-RGS2 可以显著减少RGS2的mRNA水平及蛋白水平，证明si-RGS2确实能在细胞系中起到相应的干扰作用(见图1)。

2.2 si-RGS2对RT4、T24及RT-112的增殖能力的影响 相对于对照组，si-RGS2可以显著降低人膀胱癌细胞系的增殖能力(见图2)。

2.3 si-RGS2对RT4、T24及RT-112的迁移能力的影响 与对照组相比，si-RGS2可以显著抑制人膀胱癌细胞系的迁移能力(见图3)。

2.4 si-RGS2对RT4，T24及RT-112的侵袭能力的影响 与对照组相比，si-RGS2可以显著抑制人膀胱癌细胞系的侵袭能力(见图4)。

2.5 si-RGS2对T24细胞系中转移侵袭增殖相关蛋白及P-ERK蛋白水平的影响 在T24细胞中，si-RGS2可以显著下调MMP2、MMP9、Vemintin、SNAIL及PCNA等的表达水平，且si-RGS2可以显著下调P-ERK的蛋白水平，提示敲减RGS2后，ERK/MAPK通路活性受到抑制(见图5)。

A：不同组别细胞中GFP的表达情况；B：RGS2的mRNA相对表达量统计；C：RGS2蛋白电泳及相对量统计；*：P < 0.05。图1 si-RGS2对RT4、T24及RT-112细胞RGS2的mRNA和蛋白水平的影响

人膀胱癌细胞系RT4，T24及RT-112敲减RGS2后的增殖能力的变化；*：P < 0.05;OD：Optical density。图2 CCK-8法检测si-RGS2对RT4、T24及RT-112细胞增殖能力的影响

人膀胱癌细胞系RT4，T24及RT-112敲减RGS2后，划痕实验结果代表图及相应的数据分析结果;*：P< 0.05。图3 细胞划痕法检测si-RGS2对RT4、T24及RT-112细胞迁移能力的影响

人膀胱癌细胞系RT4，T24及RT-112敲减RGS2后，Transwell侵袭实验结果代表图及相应的数据分析结果;*：P < 0.05。图4 细胞侵袭实验检测si-RGS2对RT4、T24及RT-112细胞侵袭能力的影响

A：Si-RGS2对T24细胞MMP9、MMP2、Vemintin、SNAIL及PCNA蛋白表达的影响；B：Si-RGS2对T24细胞P-ERK和ERK蛋白表达的影响;*:P<0.05。图5 蛋白印迹实验检测si-RGS2对T24细胞中转移侵袭增殖相关蛋白及P-ERK蛋白表达水平的影响

2.6 RGS2表达水平在膀胱癌病人中的表达情况及与病人总体生存率之间的关系 通过数据库Oncomine、GEPIA和UALCAN的相关数据提示，RGS2表达水平在浸润性膀胱癌患者中的表达水平要显著高于其在浅表性膀胱癌患者的表达水平，且RGS2表达水平越高，患者的总体生存率越低(P<0.05，见图6)。

A：浸润性与浅表性膀胱癌患者中RGS2的表达差异(Oncomine数据库)(P=5.00E-14)；B、C：RGS2表达水平越高，膀胱癌患者的总体生存率越低(B：GEPIA数据库；C：UALCAN数据库)(P=0.0093；P=0.024)。图6 RGS2表达水平在膀胱癌病人中的表达情况及与病人总体生存率之间的关系

3 讨论

现今，临床上诊断膀胱癌的金标准是膀胱镜检查，其它影像学手段如CT和B超等，也是重要手段，尿脱落细胞学检查等可以增加诊断的准确率。但膀胱镜对浸润性膀胱癌敏感度低，且作为一种侵入性手段，容易导致感染，B超的敏感性受到膀胱周围组织的影响，CT则对微小病灶的诊出效率欠佳，而尿脱落细胞检查敏感性较差，故而寻找新的可以广泛应用且安全方便的膀胱癌特异性肿瘤标志物成为临床上的热点。

RGS2是G蛋白信号通路调节蛋白家族中的一员，其通过抑制G蛋白α亚基的GTP酶活性，抑制G蛋白信号通路，在多种肿瘤组织中均有异常表达[13]，并与临床预后有着显著的相关性[14-18]。RGS2在不同的细胞中发挥着不同的作用，它可以调控淋巴细胞周期G0/G1期的转换，从而调控细胞的增殖[19]；可与HIF1α和MKP7发生相互作用，促进MKP7的转录，抑制细胞衰老，促进肿瘤发生[20]；RGS2还能对细胞内的低氧环境做出应答，促进髓源性抑制细胞的血管生成作用[21]，可以诱导胶质瘤细胞C6在低氧压力下发生凋亡[22]。这些研究结果表明RGS2可以通过细胞周期调控、抵抗细胞衰老、促进血管形成、控细胞凋亡等各种方式作用于细胞，而这些过程则是肿瘤进程中的关键事件。本文旨在研究RGS2是否能在膀胱癌细胞中发挥调控作用，并初步探寻其可能涉及的机制。

本研究结果显示，RGS2可以促进人膀胱癌细胞系的增殖、迁移和侵袭等肿瘤生物学行为，将RGS2敲减之后，膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力有显著削弱，而且细胞内的增殖、迁移和侵袭相关蛋白的表达水平也有着显著降低，这提示我们RGS2可以通过调控相关蛋白来发挥其对肿瘤细胞的调控作用。在机制上我们也做了初步探讨，发现RGS2敲减之后，P-ERK蛋白表达量也有了显著减少，而P-ERK是MAPK通路的关键分子之一，其表达量下调意味着敲减RGS2可通过抑制ERK/MAPK通路起到抑癌作用。更重要的是，我们通过大数据分析，发现在浸润性膀胱癌组织中的表达要显著高于其在非浸润性膀胱癌组织中的表达，且其表达水平越高，患者的总体生存率越低，这提示RGS2确实可以在临床上诊断和预测膀胱癌患者的预后中起到一定作用。

MAPK通路在多种类型的肿瘤中可以起到促癌作用，其活性的激活可以显著增加肿瘤细胞的增殖和转移。MAPK通路主要由四个亚家族构成，包括细胞外信号调节激酶(Extracellular-signalregulated protein kinase，ERK)、P38丝裂原活化蛋白激酶(P38 MAPK)、c-jun氨基末端激酶(JNK)及细胞外信号调节激酶(ERK5)，当细胞外激活信号存在时，可以通过膜受体进而级联激活RSA、MAP3K、MAP2K及MAPK，最后活化下游靶基因从而促进肿瘤进程[23]。Endale等[22]提出在大鼠C6星形细胞瘤细胞和小鼠原代星形胶质细胞中，P38/MAPK通路抑制剂SB-203580可以显著抑制RGS2的表达水平，而PKCδ的抑制剂Rottlerin也可以显著抑制缺血应激诱导的RGS2的表达水平，Kim等也提出SB-203580可以显著抑制缺血应激诱导的RGS2的表达水平[24]，这与我们的结果类似，我们的实验发现RGS2可以正向调控ERK/MAPK通路，从而为RGS2与MAPK通路之间的调控关系补充新的解释。此外，RGS家族的成员RGS5可以活化P38/MAPK通路[25]，这也从侧面对我们的结论起到一定的提示作用，即RGS家族成员与MAPK通路存在着调控关系，而MAPK家族在很多类型的肿瘤组织中存在异常激活的状态，RGS家族或许可以成为新的治疗肿瘤的靶点。Ho等[26]报道在表达D2多巴胺受体(D2R)的CHO cells(中国仓鼠卵巢成纤维细胞系)中，喹吡罗(D2R激动剂)可以剂量依赖性地激活SRE(Serum response element)，其过程需要Gαi和Gβγ参与信号转导，通路上有MAPK通路的激活作用，而RGS2或者RGS4的表达则可以逆转喹吡罗对SRE的激活作用，这也提示了RGS2或RGS4与MAPK通路之间的调控作用。

总而言之，本研究发现RGS2可以通过ERK/MAPK通路调控膀胱癌细胞的体外肿瘤学行为，且具有相关的临床意义，为临床诊疗膀胱癌提供新的思路。