于鑫欣 刘 畅 赵昀晗 徐晓娟 刘之容 张英华

（东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室 哈尔滨150030）

牛乳含有丰富的蛋白质，是人类日常饮食中氨基酸和多肽的重要来源。乳清蛋白作为牛乳中的重要组成部分，近年来被广泛地应用在功能食品、婴幼儿配方奶粉和焙烤食品中[1-2]。许多研究表明，牛乳蛋白过敏在婴幼儿中是最普遍的食物过敏，发病率为2%～6%[3-4]。大量研究表明，牛乳清蛋白中的β-乳球蛋白（β-LG）、α-乳白蛋白（α-LA）为主要的致敏原[5-7]。多种哺乳动物的乳中都含有β-LG，并且β-LG 也是牛乳中最主要的乳清蛋白[8]，而人乳中不含有[9]。婴幼儿食用后常引起过敏反应。

加热是在乳品加工生产中最常见的改性方法[10]，能够改变蛋白质结构，通过掩盖或暴露抗原表位来影响抗原性，然而，加热仅能够改变蛋白质的空间结构，而致敏氨基酸序列不受影响[11]。热处理通过改变蛋白质的构象而改变应变原性，从而影响它们与其它物质的相互作用，比如酶法交联反应[12-13]。化学试剂处理也是改变食品原料蛋白性质的另一途径[14-15]。但是，应用的化学试剂要充分考虑到安全因素，因此，选用安全的化学试剂进行蛋白质改性具有重要意义。

基于乳清蛋白主要成分的结构特性，采用物理加热的方法或者添加安全还原剂半胱氨酸，改变α-LA 和β-LG 的蛋白质空间结构，破坏二硫键，以降低其致敏性[16]。本研究采用加热和半胱氨酸还原这2种能够使蛋白质分子结构打开的方式处理乳清蛋白，考察不同打开方式对蛋白质的抗原性以及对其酶法交联程度的影响[17]，为生产功能性质良好且致敏性低的乳清蛋白制品提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

α-乳白蛋白，β-乳球蛋白，十二烷基磺酸钠（SDS），8-苯氨基-1-萘磺酸，甲叉双丙烯酰胺，美国Sigma（Saint Louis）公司；乳清蛋白，北京泛亚乳品公司；转谷氨酰胺酶（TGase-N），江苏一鸣精细化工公司；半胱氨酸，天津博迪化工有限公司；丙酰胺烯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；羊抗兔IgG，北京索莱宝科技有限公司。其它试剂均为分析纯级或生化纯级。

1.2 仪器与设备

UV-2401PC 型紫外-可见分光光度计，日本岛津公司；3K15 高速冷冻离心机，曦玛离心机（扬州）有限公司；DYY-6C 电泳仪、DYCZ-28A 电泳槽、680 型酶标仪，北京六一仪器厂；F-4500 型荧光分光光度计，日本日立公司；DHP-9082 型电热恒温培养箱，上海一恒科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 乳清蛋白改性产物的制备

1.3.1.1 加热改性乳清蛋白样品的制备 配置质量浓度30 g/L，pH 7.0 的乳清蛋白溶液，分别于60，70，80 ℃加热10 min 后冷却至室温。向不同温度处理后的样品中加入5 U/g 蛋白的转谷氨酰胺酶，37 ℃水浴反应4 h，反应结束后80 ℃灭酶10 min，取出冷却至室温。以原料乳清蛋白为对照，稀释到一定倍数后进行固有荧光发射光谱扫描、表面疏水性、SDS-PAGE 蛋白质凝胶电泳、抗原性的测定。

1.3.1.2 半胱氨酸改性乳清蛋白样品的制备 半胱氨酸溶液配制：半胱氨酸固体在0.1 mol/L 的HCl 中溶解，待溶解完全后用0.05 mol/L NaOH 调pH 至7.0。

将含有0.05，0.15，0.25 mmol/g 蛋白的半胱氨酸（Cys）的乳清蛋白溶液（乳清蛋白溶液质量浓度30 g/L，pH 7.0）于37 ℃水浴30 min，向不同剂量半胱氨酸处理的样品加入5 U/g 蛋白的转谷氨酰胺酶，37 ℃水浴反应4 h，反应结束后85 ℃灭酶10 min，取出冷却至室温。以原料乳清蛋白为对照样，检测一系列理化性质、功能性质、抗原性和结构性质。

1.3.2 乳清蛋白改性产物的性质分析

1.3.2.1 蛋白质含量的测定 采用凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2010）检测蛋白质含量[18]。

1.3.2.2 疏水性的测定

1）固有荧光发射光谱扫描 将待测蛋白用50 mmol/L 的磷酸盐缓冲溶液（pH 7.0）稀释至5 mg/mL。于激发波长280 nm，激发波狭缝宽度5 nm，发射波狭缝宽度5 nm，发射光谱检测范围290～420 nm，扫描速度240 nm/min 下进行扫描。

2）表面疏水性的测定 将蛋白质样品用0.01 mol/L 磷酸缓冲溶液（pH 7.0）由0.5 g/L 梯度稀释至0.1 g/L，采用1-苯胺-8-萘-磺酸盐（ANS）荧光探针法[19]测定表面疏水性。

1.3.2.3 SDS-PAGE 凝胶电泳 参照张杉等[20]的方法进行SDS-PAGE 凝胶电泳。

1.3.2.4 乳清蛋白改性产物抗原性测定 采用间接竞争酶联免疫法（IELISA）测定乳清蛋白修饰产物抗原性，参照袁水林等[21-22]的方法。以α-LA 和β-LG 标准品制作标准曲线。

1.3.3 数据统计与分析 试验数据均表示为平均数±标准差，且试验数据应用SPSS Statistics 16.0软件的One-way AVONA（单因素方差分析）和多组数据间的Duncan 法进行统计与分析，P<0.05 表示差异显著。图表绘制应用Excel（2010）软件。

2 结果与分析

2.1 疏水性测定结果

2.1.1 固有荧光性 蛋白质内部的发色氨基酸所造成的荧光参数的变化可以反映出蛋白质结构的变化，其中色氨酸含有能引起最高辐射率和荧光产量的吲哚发色团，所以色氨酸对蛋白质内部环境的敏感性较高。通常，当色氨酸所处结构环境由疏水性向极性转变时，发射荧光强度会下降[23]。因此，检测色氨酸的荧光参数能够准确地反映出邻近区域蛋白结构的变化情况。

不同加热温度与不同半胱氨酸添加量改性乳清蛋白样品的相对荧光强度测量结果如图1所示。

图1 加热与半胱氨酸改性乳清蛋白样品的固有荧光发射光谱Fig.1 Intrinsic fluorescence emission spectra of whey protein modified by heat and cysteine

由图1可看出，乳清蛋白改性样品的荧光强度在发射波长345 nm 附近达到最大值。加热与半胱氨酸处理对乳清蛋白的固有荧光性均有很大影响，2种方式处理的乳清蛋白改性产物的相对荧光强度均大于未处理乳清蛋白，且随着处理乳清蛋白的温度和半胱氨酸添加量的增加，相对荧光强度也逐渐增加。加热处理能够打开蛋白质结构并暴露乳清蛋白的疏水基团，而半胱氨酸作为一种还原剂，可以改变蛋白质分子间或分子内部的二硫键，2种方式对乳清蛋白结构的打开方式不同[24]，但都能够提高乳清蛋白改性产物的固有荧光性。比较2种不同处理方式对改性乳清蛋白固有荧光性的影响，明显看出加热对乳清蛋白的固有荧光性结果有更大的影响，加热处理的乳清蛋白改性产物的固有荧光性大于半胱氨酸处理的乳清蛋白改性产物。

2.1.2 表面疏水性 不同加热温度与不同半胱氨酸添加量对乳清蛋白样品的表面疏水性的影响如图2所示。

从图2 中可以看出，加热处理与半胱氨酸处理后的乳清蛋白的表面疏水性均明显高于原料乳清蛋白，且呈正相关关系。说明2种处理能够使蛋白质的疏水基团暴露，增强乳清蛋白的疏水性。然而加热处理后的乳清蛋白的表面疏水性普遍高于半胱氨酸改性乳清蛋白，采用60 ℃的加热处理的乳清蛋白的表面疏水性高于采用0.25 mmol/g 蛋白质半胱氨酸改性处理的乳清蛋白。该结果与固有荧光性分析的结果一致。

图2 加热与半胱氨酸处理对乳清蛋白样品的表面疏水性的影响Fig.2 Effects of surface hydrophobicity of whey protein modified by heat and cysteine

2.2 加热及半胱氨酸改性对乳清蛋白TGase 交联产物的影响

加热及半胱氨酸改性乳清蛋白产物的SDSPAGE 电泳图谱如图3所示。

从图3（a，b）可以看出，加热处理的乳清蛋白与原料乳清蛋白的分子质量没有明显变化，然而加热温度达到80 ℃时，在电泳图相应泳道上方可看到少量大分子质量蛋白质聚集。这可能是由于较高温度的加热使蛋白质结构被打开，增加了基团的暴露和基团间的相互接触，形成了少量的蛋白质共聚物，半胱氨酸的加入对乳清蛋白的分子质量同样没有影响。添加有TGase 的乳清蛋白样品（图a，b 中的2，4，6，8 泳道）条带明显存在大分子聚合物的深色区域。结果表明，TGase 的加入能够使蛋白质发生交联反应，而且分别比较加热与半胱氨酸改性的交联产物可知，加热处理后进行交联所得产物中大分子聚合物含量多于未加热处理的交联乳清蛋白，且当加热温度增加时，大分子聚合物的含量也逐渐增加，说明了加热作为前处理方式，能够使蛋白质结构得到舒展，有助于TGase 交联蛋白形成大分子聚合物；半胱氨酸改性乳清蛋白所得的交联产物中大分子质量蛋白质含量大于未改性的TGase 交联乳清蛋白，当添加量为0.25 mmol/g 蛋白质时乳清蛋白交联产物形成的共聚物含量最多。比较2种处理方式对TGase 交联产物的含量的影响，由电泳图可知，半胱氨酸改性的颜色明显深于加热改性，说明半胱氨酸改性更有利于乳清蛋白的TGase 交联。

图3 加热与半胱氨酸改性乳清蛋白的SDS-PAGE 电泳图谱Fig.3 Electrophoretic profiles of whey protein modified by heat and cysteine

2.3 加热及半胱氨酸改性对乳清蛋白抗原性的影响

通过α-LA 和β-LG 的标准曲线计算出原料乳清蛋白、加热改性乳清蛋白、半胱氨酸改性乳清蛋白中的抗原含量，如表1所示。

表1 加热及半胱氨酸改性乳清蛋白产物中α-LA 和β-LG 抗原的含量Table 1 Amount of α-LA and β-LG with antigenicity of whey protein modified by heat and cysteine

从表1可以看出，加热与半胱氨酸处理后乳清蛋白中α-LA 和β-LG 的抗原含量较原料乳清蛋白中抗原含量均有所减少。且温度在80 ℃时样品中α-LA 和β-LG 的含量最少，为6.103 μg/mL和35.58 μg/mL，抗原性下降20%左右；半胱氨酸添加量为0.25 mmol/g 蛋白质时，α-LA 含量从原料乳清蛋白中的7.749 μg/mL 减少到5.370 μg/mL；β-LG 的含量则从44.41 μg/mL 减少到29.60 μg/mL，抗原性下降达30%以上。结果表明半胱氨酸改性比加热处理更能显著降低乳清蛋白的抗原性。

3 结论

3.1 加热与半胱氨酸改性对乳清蛋白疏水性的影响

加热与加入半胱氨酸还原剂改性乳清蛋白均能改变其结构，增加乳清蛋白的固有荧光性与表面疏水性。2种处理方式进行比较，结果表明：热处理乳清蛋白改性产物的固有荧光性及表面疏水性比半胱氨酸改性产物高，且加热方法对乳清蛋白的疏水性影响较半胱氨酸改性方法大。

3.2 加热与半胱氨酸改性对乳清蛋白TGase 交联的影响

加热处理有利于TGase 交联蛋白形成大分子聚合物，且加热温度增加时，大分子聚合物的含量也逐渐增加。半胱氨酸改性同样有利于乳清蛋白的TGase 交联，且添加量越多，交联产物越多。SDS-PAGE 结果表明半胱氨酸改性得到的大分子交联产物含量更多，说明半胱氨酸更有利于乳清蛋白的TGase 交联。

3.3 加热与半胱氨酸改性对乳清蛋白抗原性的影响

加热处理使乳清蛋白中抗原含量下降20%左右，半胱氨酸改性使乳清蛋白中抗原含量下降达30%以上。结果表明半胱氨酸改性比加热处理更能显著降低乳清蛋白的抗原性。