郭宝凤 ，周雪梅 △

（1.内蒙古自治区药品检验研究院，内蒙古 呼和浩特 010010； 2.内蒙古自治区中蒙药标准研究重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010010）

蒙医常用灰绿黄堇作“地格达”使用，效果较好，但作为蒙药材，现暂无质量标准，未能对该产品的质量进行监控。灰绿黄堇（蒙医名为柴布日-萨巴乐干纳），为罂粟科紫堇属植物灰绿黄堇Corydalis aduncaMaxim.的干燥全草，功能主治为清热解毒、消炎、凉血、解毒、利尿，用于治疗时疫感冒、咽喉肿痛、疔疮肿痛等［1-5］。灰绿黄堇主要含有紫堇碱、去氢紫堇碱、二氢血根碱、延胡索乙素等多种生物碱类成分［3-5］，有镇痛、止咳、松弛平滑肌、平喘、抗菌的作用［6-7］。本研究中采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法对蒙药材灰绿黄堇中原阿片碱含量进行了测定，为灰绿黄堇的质量控制提供了定量检测方法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

DionexU-3000型双三元型高效液相色谱仪（带二极管阵列检测器，美国Thermo公司）；Sartorius ME5型电子天平（德国赛多利斯公司，精度为百万分之一）；Mettler AE-100型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度为万分之一）；AS 5150A型超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司，功率为500 W，频率为50 kHz）。

1.2 试药

紫堇灵对照品（批号为111734-200601），延胡索乙素对照品（批号为110726-201213），盐酸巴马汀对照品（批号为110732-200506），原阿片碱对照品（批号为 110853-201404），盐酸黄连碱对照品（批号为112026-201601），均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为离子交换高纯水；10批灰绿黄堇为蒙医医院提供或自采样品，样品信息见表1。所有样品均由内蒙古自治区药品检验研究院主任中药师周雪梅鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：AlltimaC18-ODS柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺调pH至6.0，15 ∶85，V／V）；检测波长：289 nm；流速：1.0 mL ／min；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。

表1 样品信息来源

2.2 溶液制备

取原阿片碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含60 μg的溶液，即得对照品溶液。取样品粉末（过3号筛）约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率为250 W，频率为50 kHz）60 min，取出，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：精密吸取上述2种溶液各10 μL，分别注入色谱仪，按拟订色谱条件进样测定。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同的色谱峰且光谱图一致。理论板数以原阿片碱峰计为10732，分离度为6.7。理论板数以原阿片碱峰计不小于4000。详见图1。

线性关系考察：取原阿片碱对照品（含量为99.77%）5.388 mg，置 50 mL 容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度，精密吸取 2，5，10，15，20 μL 注入液相色谱仪，按拟订色谱条件进样测定，以进样量（C）为横坐标、峰面积（A）为纵坐标进行线性回归，得回归方程A＝0.020 8C-0.026 60.040 8（r＝0.999 9）。结果表明，原阿片碱进样量在107.44～1 611.5 ng范围内与峰面积线性关系良好。

图1 灰绿黄堇反相高效液相色谱图及光谱图

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液10 μL，重复进样5次，计算原阿片碱峰面积积分值。结果的RSD为0.68%（n＝5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于2，4，6，8，12，24 h时进样10 μL，依法测定，计算原阿片碱峰面积积分值。结果的RSD为0.75%（n＝2），表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：取同一供试品（S1）6份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定原阿片碱含量。结果原阿片碱平均含量为 1.588mg／g，RSD为 1.75%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取同一供试品（S1），含量为 1.588mg／g）6份，各1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入对照品溶液 25 mL（质量浓度为 0.058 6 mg ／mL），精密加甲醇25 mL，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定原阿片碱含量，计算回收率。结果见表2。

表2 原阿片碱加样回收试验结果（n＝6）

耐用性试验：换不同厂家、不同型号的色谱柱，按拟订色谱条件进样测定，色柱谱为Alltima C18，Phenomenex C18，Agilent C18，Shimadzu C18，色谱柱分离度均大于 1.5，测得平均含量分别为 1.59，1.61，1.60，1.57 mg ／g。与本研究中采用的AlltimaC18柱测得平均含量（1.59mg／g）相对误差分别为 0.62%，0.32% ，0.64% 。不同厂家、不同型号的色谱柱对测定结果无影响。

2.4 样品含量测定

取10批供试品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进行测定。结果见表3。）

表3 原阿片碱含量测定结果（mg／g，n＝2）

3 讨论

3.1 色谱条件选择

本研究中对流动相［甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺调pH 至 6.0）、甲醇 -0.1%磷酸溶液、乙腈 -0.1%磷酸溶液（三乙胺调 pH 至 6.0）、乙腈 -0.1%磷酸溶液］、柱温（30℃、35℃、40℃）进行考察。结果柱温35℃、流动相甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺调pH至6.0）的色谱条件下等度洗脱时，各色谱峰与相邻峰分离较好，且基线平稳。

3.2 检测波长选择

通过二极管阵列检测器对对照品在800～190 nm波长范围内进行光谱扫描，结果原阿片碱在289.3 nm皮长处有最大吸收峰，参照文献［2，6-7］。故选择测定波长为289 nm。

3.3 指标成分选择

本研究中采用RP-HPLC法建立蒙药材灰绿黄堇的含量测定，曾摸索盐酸罂粟碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、延胡索乙素、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、原阿片碱的含量测定方法［8-14］。结果灰绿黄堇色谱图中没有与盐酸罂粟碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、延胡索乙素、盐酸药根碱保留时间一致的色谱峰，或虽保留时间一致，但光谱图不同，供试品色谱图中有与原阿片碱和盐酸黄连碱保留时间一致的色谱峰，且光谱图一致，分离效果较好，盐酸黄连碱含量较低，故以原阿片碱为指标成分建立含量测定方法。

3.4 提取方法选择

比较了甲醇加热回流和超声提取2种方法，结果差异不明显，因超声提取更简便、易行，故选择超声提取法。分别比较了甲醇浸泡1 h后超声和直接超声提取2种方法，结果差异不大，故选择甲醇超声提取。比较了超声处理（功率为 250 W，频率为 50 kHz）30，60，120 min，进行试验，按拟订色谱条件测定，结果超声处理60 min后原阿片碱的含量不再增加，故确定超声时间为60 min。

3.5 方法评价

本研究中建立了测定原阿片碱含量的RP-HPLC法，该方法，简便、准确，可作为灰绿黄堇质量控制的定量方法。