细菌瓶法用于产甲烷菌菌量的测定*

2020-10-15易绍金邱思语

油田化学 2020年3期

易绍金，邱思语，余灿，2

（1.长江大学化学与环境工程学院，湖北荆州 434023；2.中石化江汉石油工程设计有限公司，湖北武汉 430200）

产甲烷菌（methane-producing bacteria，简称MPB）是一类能够将无机或有机化合物厌氧发酵转化成甲烷等的古细菌［1-3］。它是微生物采油功能菌之一［4-8］，也被应用于污泥厌氧消化过程中［9-10］，是废水生物处理的重要菌群［11-12］，同样也是沼气发酵的主要菌群［13-16］。因此，在微生物采油（microbial enhanced oil recovery，简称MEOR）尤其是本源微生物采油研究和应用、废水厌氧生物处理及沼气发酵领域等工作过程中常常需要测定MPB 的菌量。目前主要采用Hungate 滚管培养法测定MPB 菌量，采用该法测试需要严格的厌氧无菌环境和特殊的实验装置——滚管机，但滚管机操作繁琐、费时、效率低下，而且计数采用活菌计数法存在计数不准、读数不精确的明显缺陷。目前的MPB 菌量测定的工作效率极低，需要一定的操作技术和操作条件，不能满足现代高效工作的需要，因此，需要研制一种快速方便且准确的MPB菌量的新方法、新工具。

1989年，孙炳德［17］使用细菌瓶法测定了硫酸盐还原菌（SRB）的菌量，认为细菌瓶法是一种高效、准确的测定菌量的一种方法。随后易绍金［18-20］将细菌瓶法应用于测定石油烃降解菌、产表面活性剂菌、黄原胶降解菌等细菌的菌量，扩大了细菌瓶法测定细菌的种类和范围。国内早已采用了既简便又准确的细菌测试瓶法，如北京华兴化学试剂厂生产的SRB 细菌测试瓶，细菌瓶内装有SRB 专用培养基，但只能用于测定SRB 而不能用于测定MPB。由于MPB 测定需要严格的厌氧环境，且滚管机不易携带，Hungate滚管培养法不适用于现场测定，改进方法大多数以滚管机为基础，测定条件苛刻，目前仍没有一种较好的测定MPB 菌量的方法。为了更加方便且易于测定MPB的菌量，本文根据细菌瓶法的基本原理，研制了用于培养MPB的专用测试瓶，内含有MPB的专用培养基，并进行了许多样品的实际测试。

1 实验部分

1.1 仪器

STARTER3100 型pH 计，奥豪斯仪器设备有限公司；SPX-300BS-Ⅱ型生化培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；YM 型不锈钢立式电热蒸汽消毒器，上海三申医疗器械有限公司；YQX-Ⅱ厌氧培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；R05型厌氧培养滚管机，北京丰美仪器公司；螺口厌氧培养管，1.0 mL一次性无菌注射器，山东威高集团高分子制品股份有限公司。

1.2 MPB测试瓶的制备

（1）MPB培养液的配制。通过比较不同配方培养液培养MPB 的生长速度优选培养液配方，反复筛选得到了以低分子有机酸盐［21，22］为碳源，含有铵盐、磷源和化学脱氧剂等组分的专门用于培养MPB 的培养液配方及其合适的pH 值。该培养基的配方是按照MPB 的生理生化特性所设计，所培养的细菌只是在厌氧条件下将低分子有机酸裂解为甲烷等的MPB［21-22］，测试工作不会受其它细菌的干扰。

（2）生长指示。为了及时准确地反映培养液中有无MPB 的生长，必须确定易于观察的生长指示，要求生长指示特异性强，易于判断。根据MPB代谢特点和代谢产物确定其生长指示。MPB 的正常生命代谢会让培养液变浑浊，在厌氧条件下会将低分子有机酸裂解为甲烷等，即培养液变浑浊并且有气泡即为MPB的生长指示［23］。

（3）测试瓶制备与灭菌。将配制好的培养液在厌氧培养箱中分装入标准玻璃瓶（15 mL）中，每瓶装9.0 mL 培养液，然后进行橡胶盖和铝盖封口，再按常规灭菌，即成为MPB测试瓶。