李阿楠，张晓序，任翠平，沈际佳，左春林

桥本甲状腺炎(Hashimoto thyroiditis，HT)又称慢性淋巴细胞性甲状腺炎，是由多种因素导致的一种器官特异性自身免疫性甲状腺疾病[1]。该病早期没有明显的临床症状，随着疾病进展则有甲状腺功能减退的表现。其病理特点主要表现为淋巴细胞的浸润，同时可伴有淋巴滤泡形成。研究[2]表明，自杀相关因子(factor associated suicide，Fas)介导的细胞凋亡可能是引起甲减的重要途径。Fas的表达变化可能受局部炎性环境的影响，如促炎因子白细胞介素1-β(interleukin-1β，IL-1β)、干扰素-γ(interferon-γ，INF-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等[3-4]。前期研究[5]表明IL-1β在HT患者甲状腺组织中高表达，可能与甲状腺细胞的Fas表达增加相关，但具体机制不明。该研究将通过体外培养大鼠甲状腺细胞系(FRTL-5细胞)，探究IL-1β是否通过影响Fas和caspase-8的表达来调控甲状腺细胞凋亡，从而探讨IL-1β在HT发病机制中的作用，为HT的临床治疗提供一个潜在的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料大鼠甲状腺细胞FRTL-5(美国ATCC公司)；重组人IL-1β(美国Sigma公司)；Z-IETD-FMK抑制剂(美国R&D公司)；胎牛血清、RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)；0.25%胰酶细胞消化液(上海碧云天生物技术有限公司)； TRIzol试剂盒(美国Invitrogen公司)；逆转录试剂盒(美国Thermo公司)；荧光定量PCR检测试剂盒(日本TaKaRa公司)；Annexin V-FITC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒(上海贝博公司)；八连管及八连管盖(美国ABI公司)；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 将FRTL-5细胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的恒温培养箱中，细胞呈贴壁成长。当细胞生长密度达到70%～80% 时，可用胰酶消化、传代，或按所需浓度接种到培养板中。

1.2.2细胞干预 将对数生长期的FRTL-5细胞以5×105个/孔的密度接种于6孔板中，用不同浓度(10、20、40 ng/ml)的IL-1β处理细胞，同时设置对照组(不加IL-1β)，继续培养48 h后，收集细胞用于后期检测；接上步检测，用20 ng/ml的IL-1β处理细胞，再分别培养6、12、24、48 h，并设置对照组(0 h处理)，收集细胞用于后期检测。

1.2.3FRTL-5细胞总RNA提取和RT-PCR 用预冷的PBS洗涤2～3次，按照TRIzol试剂盒说明书提取各组细胞的总RNA。采用Nano Drop仪器检测RNA浓度后，根据Thermo逆转录酶说明书将总RNA逆转录成cDNA，以此为模板，使用RT-PCR仪检测相关基因的表达。RT-PCR反应条件:95 ℃、10 s预变性；95 ℃、15 s，60 ℃、40 s扩增40循环；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s延伸(熔解曲线)。以β-actin作为内参，采用2-ΔΔCt法比较分析目的基因表达。引物见表 1。

表1 引物序列

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡 将对数生长期的FRTL-5细胞以5×105个/孔的密度接种于6孔板中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞生长至70%～80%时，分别设置对照组(含0.5% BSA)、IL-1β 10 ng/ml和IL-1β 20 ng/ml诱导组及Z-IETD-FMK 20 μmol/L组。对照组和IL-1β组于培养箱中继续培养24 h。Z-IETD-FMK组先以20 μmol/L预孵1 h后，再添加终浓度为20 ng/ml的 IL-1β，于培养箱中继续培养24 h。用不含EDTA胰酶消化后离心，收集细胞于EP管中。用预冷的PBS洗涤1～2次，进行离心4 ℃，1 000 r/min，5 min。加入1×Annexin V结合液调整细胞密度为1×106个/ml。在细胞悬浮液中加入5 μl Annexin V-FITC染色液，轻轻混匀，于2～8 ℃避光孵育15 min后，加入10 μl PI染色液，避光孵育5 min。1 h内用流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)检测。记录4组细胞凋亡细胞百分率，实验重复3次。

2 结果

2.1 IL-1β对FRTL-5细胞Fas mRNA表达水平的影响RT-PCR测定结果显示，与对照组比较，IL-1β刺激组FRTL-5细胞Fas mRNA的表达量呈剂量依赖性增加。其中20 ng/ml组和40 ng/ml组高于对照组，差异有统计学意义(t=10.61,P<0.05；t=4.309,P<0.05)，如图1A。Fas mRNA的表达量与IL-1β作用呈时间依赖性，与对照组相比，予20 ng/ml 浓度IL-1β作用6、12、24、48 h时Fas mRNA表达均增高，差异有统计学意义(F=9.29，P<0.05)，如图1B。

图1 IL-1β对FRTL-5细胞Fas mRNA表达水平的影响A：不同剂量IL-1β对FRTL-5细胞Fas mRNA表达水平的影响；B：不同时间IL-1β对FRTL-5细胞Fas mRNA表达水平的影响；与对照组(0 ng/ml)比较：*P<0.05；与对照组(0 h)比较：#P<0.05

2.2 Z-IETD-FMK对IL-1β诱导FRTL-5细胞凋亡的影响不同浓度(10 ng/ml IL-1β及20 ng/ml IL-1β)分别干预FRTL-5细胞24 h后，甲状腺细胞凋亡率分别为(11.45%±1.826%)和(21.60%±3.00%)，其中，IL-1β干预组(20 ng/ml)与对照组(7.74%±1.68%)比较，差异有统计学意义(F=98.99,P<0.05)。预先给予caspase-8抑制剂Z-IETD-FMK 1 h后再予IL-1β干预细胞24 h，结果显示，甲状腺细胞凋亡率为(9.18%±2.83%)，与 IL-1β 干预组(20 ng/ml)比较，甲状腺细胞的细胞凋亡率下降，差异有统计学意义(F=61.51,P<0.05)。如图2。

图2 IL-1β通过caspase途径介导FRTL-5细胞的凋亡A：流式检测细胞凋亡；B：细胞凋亡率柱状图；1：对照组；2：10 ng/ml IL-1β组；3：20 ng/ml IL-1β组；4：20 μmol/L Z-IETD-FMK+20 ng/ml IL-1β组；与对照组比较：*P<0.05；与20 ng/ml IL-1β组比较：#P<0.05

3 讨论

HT是常见的自身免疫性甲状腺疾病之一，其发病机制尚未完全明了，可能与遗传、环境因素及自身免疫异常有关[1, 6-7]。HT患者甲状腺组织中存在着细胞凋亡，主要特征有甲状腺细胞存在胞核分裂、胞质浓缩、胞膜水肿、内源性核酸内切酶所致的DNA 断裂等。Fas介导的细胞凋亡在HT发病过程中起着重要的作用，Giordano et al[8]发现Fas在HT患者甲状腺组织中的表达较甲状腺肿患者显著增加，细胞凋亡也明显增加。在凋亡相关受体如Fas、DR4和DR5等介导的细胞凋亡途径中，caspase-8可能是关键的启动子，活化后的caspase-8能够引发caspase蛋白酶解级联反应，最终导致细胞凋亡。并且caspase-8几乎能激活所有凋亡级联反应下游的caspase而诱发凋亡[9]。

炎性细胞因子在HT的发病过程中起着重要作用[10-11]，主要包括Th1细胞分泌的IL-2、IFN-γ和TNF-α以及Th2细胞分泌的IL-4、IL-6、IL-13等。IL-1家族成员在多种疾病的免疫发病机理中起关键作用，其中细胞因子(IL-1β、IL-18、IL-α、IL-33等)具有促炎活性。IL-1β是其家族中的一种异构形式，主要由活化的单核细胞和巨噬细胞产生，参与多种疾病的发生发展，如糖尿病、阿尔茨海默病、癫痫等[12-14]。本课题组的前期研究[15]显示，尽管HT和格雷夫斯病(Graves' disease,GD)患者血清IL-1β水平与正常人比较差异无统计学意义，但小样本外周血单个核细胞分离后，HT患者IL -1β mRNA表达高于GD患者和正常人，提示IL-1β可能是参与HT而非GD发病的炎性因子之一，但目前缺乏相关的大样本临床研究。该研究结果显示IL-1β上调甲状腺细胞Fas的表达，启动Fas途径诱导甲状腺细胞凋亡。IL-1β诱导的甲状腺细胞凋亡被caspase-8抑制剂所阻遏，提示IL-1β引起甲状腺细胞的凋亡可能通过Fas和caspase途径而发挥作用。