徐仕珍，杨维虹,毛 玲,刘兴容

龋病的发生发展就是从获得性膜的形成、细菌黏附、牙菌斑生物膜形成到引起牙齿的颜色、形态和质地发生损害性改变，其中牙菌斑生物膜的形成与龋病发生密切相关[1]。变异链球菌(Streptococcusmutans,S.mutans)是造成龋病的最主要的细菌[2]，其致龋性毒力作用基础包括产酸和耐酸、定植牙面形成生物膜及合成胞内外多糖能力[3]。高温需要蛋白A (high temperature requirement A，HtrA)是细菌体内的一种热休克蛋白质分子，能够帮助细菌逃避高温、高渗和高氧浓度等环境的变化[4-5]。Gasc et al[6-8]首次在肺炎链球菌中发现了HtrA,并发现其参与控制多种细菌毒力因子的表达。课题组前期实验[9]发现HtrA对变异链球菌的耐酸和黏附有重要调控作用。该实验旨在利用乳牙高致龋性的HtrA基因缺陷株，探讨HtrA的缺失对S.mutans生物膜的影响，为龋病的防治提供新的着手点。

1 材料与方法

1.1 实验菌株乳牙S.mutansHtrA高毒力株与缺陷株由课题组前期获得；S.mutans国际标准株UA159自四川大学华西口腔医学院国家重点实验室获得。

1.2 主要实验试剂MS固体培养基(美国BD公司)；BHI培养基(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)；甘露糖、蜜二糖、棉子糖、山梨醇、精氨酸双水解酶肉汤细菌微量生化鉴定管、七叶苷培养基(北京陆桥技术有限责任公司)。

1.3 实验方法

1.3.1S.mutans的复苏与培养 UA159标准株、HtrA高毒力株与基因缺陷株复苏经生化鉴定后接种于MS固体培养基，37 ℃厌氧(80% N2、10% H2、10% CO2)培养48 h。

1.3.2S.mutans体外非应激环境下[37 ℃、厌氧(80% N2、10% H2、10% CO2)]的生长曲线测定 挑选3个菌株的单菌落至BHI液体培养基中，37 ℃厌氧培养24 h；离心，弃上清液，无菌生理盐水漂洗，重复3次；加入BHI溶液稀释菌液，调节3组菌悬液使酶标仪测量吸光度(optical density, OD)600=0.05；37 ℃厌氧培养，在2、4、6、8、10、12、14、16 h时每组每管分别吸取100 μl细菌悬液加入96孔板，测定OD600值。

1.3.3S.mutans生物膜结晶紫染色定性分析

1.3.3.1S.mutans菌液浓度的调节 HtrA高毒力株与基因缺陷株菌液各2支，重复步骤1.3.2项使两菌液OD600=1.0，稀释10倍备用。

1.3.3.2S.mutans生物膜体外构建 取5块一次性无菌6孔板，每孔放入预处理的22 mm×22 mm无菌盖玻片一张，每两孔分别加入HtrA高毒力株菌液、HtrA基因缺陷株菌液，BHI液体培养基，每孔5 ml；37 ℃厌氧培养；培养的1、4、8、12、24 h随机取出一块6孔板，做后续染色处理。

1.3.3.3结晶紫染色定性分析 随机取出一块6孔板，吸干菌液，每孔加入PBS 5 ml，漂洗，吸出，重复3次，吸干；甲醇固定15 min，PBS洗净，1%结晶紫染色5 min，取出盖玻片，PBS冲掉多余染液后放于无菌载玻片上，显微镜油镜下观察。

1.3.4S.mutans生物膜扫描电镜观察

1.3.4.1S.mutans菌液浓度的调节 UA159标准株、HtrA高毒力株与HtrA基因缺陷株菌液各1支，重复1.3.2项使3组菌液OD600=1.0为止，稀释10倍备用。

1.3.4.2氧化锆片表面细菌生物膜的培养 一次性无菌24孔板1个，11枚抛光处理过的无菌氧化锆片间隔放入孔内，每孔加入0.5 ml无菌唾液淹没氧化锆片，37 ℃孵育4 h；取出24孔板，去除唾液，于有氧化锆片的孔中每孔加入0.8 ml含10 g/L蔗糖的BHI液体培养基、0.8 ml无菌唾液、200 μl调好浓度的细菌悬液(UA159标准株、HtrA高毒力株与HtrA基因缺陷株各加3个孔，余下2孔加200 μl无菌生理盐水作为空白对照组)，37 ℃厌氧培养12 h。

1.3.4.3扫描电镜标本的制作与观察 取出24孔板，无菌生理盐水漂洗，每孔中加入2 ml 2.5%戊二醛溶液，4 ℃固定4 h；吸干，将氧化锆片转入一块新的24孔板内，PBS漂洗2次，15 min/次，乙醇梯度脱水，样本干燥喷金，扫描电镜镜检。

1.3.5S.mutans细菌生物膜结晶紫半定量分析

1.3.5.1S.mutans菌液浓度的调节 与1.3.4.1同。

1.3.5.2S.mutans细菌微孔生物膜的培养 取4块无菌96孔板，加入调配好浓度的菌液200 μl/孔，第一排为HtrA高毒力株，第二排为UA159标准株，第三排为HtrA基因缺陷株，每种菌液设置10个复孔；37 ℃厌氧培养，分别于4、8、12、24 h随机取出一块96孔板，做后续处理。

1.3.5.3结晶紫染色半定量分析 随机取出一块96孔板，PBS洗板3次，吸干，室温干燥30 min；加入1%结晶紫染色液200 μl/孔，静置20 min吸出；PBS漂洗3次，吸干后干燥30 min；加入95%乙醇，200 μl/孔，振荡30 min，测定OD600值。

2 结果

2.1S.mutans菌株生化鉴定结果HtrA高毒力株、HtrA基因缺陷株和UA159标准株均可分解甘露糖、山梨醇、密二糖、棉子糖，水解七叶苷，但不水解精氨酸。

2.2S.mutans菌株体外非应激环境下的生长曲线测定3组S.mutans菌株在体外非应激环境下的生长曲线趋势基本一致，但在细菌增殖的各个阶段，HtrA高毒力株与UA159标准株相对于HtrA基因缺陷株具有更高的细菌浓度(以OD600值计算)。HtrA高毒力株与HtrA基因缺陷株比较，2 h后差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 3组菌株生长曲线测定结果与HtrA基因缺陷株比较：*P<0.05，**P<0.01

2.3S.mutans生物膜结晶紫染色定性分析结晶紫染色后油镜下观察24 h，随着时间推移，各菌株密集度逐渐加大。但不同时间段两者细菌密集度不同，HtrA高毒力株密度明显高于HtrA基因缺陷株。见图2。

图2 HtrA高毒力株和HtrA基因缺陷株结晶紫染色油镜观察 ×1 000A：HtrA高毒力株；B：HtrA基因缺陷株；1：1 h；2：4 h；3：8 h；4：12 h；5：24 h

2.4S.mutans生物膜扫描电镜观察扫描电镜下观察3个菌株的密度HtrA高毒力株密度最大，UA159标准株稍次之，HtrA基因缺陷株密度最低。见图3。

图3 HtrA高毒力株、UA159标准株和HtrA基因缺陷株扫描电镜下观察A：HtrA高毒力株;B:UA159标准株;C:HtrA基因缺陷株;1:×1 000;2:×10 000

2.5S.mutans细菌生物膜结晶紫半定量分析4、8、12、24 h HtrA高毒力株与HtrA基因缺陷株比较，OD600值差异均有统计学意义(P<0.001)。见表1。

表1 3个菌株不同时间点结晶紫染色OD600值

3 讨论

生物膜是微生物黏附于牙面形成的复合体，是S.mutans赖以生存的微生态环境，它的形成包括两个过程，即早期细菌黏附牙面和后期细菌相互作用、集聚。丝氨酸蛋白酶的HtrA家族分布广泛，在多种细菌、植物及人体内都发现其同系物，这种蛋白酶具有管家蛋白的作用，能降解错误折叠的蛋白质，维持细菌的生理稳态和适应外界应激环境起重要作用[10]。Ahn et al[11]在S.mutans中仅发现一个HtrA基因的存在，并且证明了它不仅是调控S.mutans的生长和耐热性的关键因子，还是调控S.mutans某些基因转录和生物膜形成的关键因子。

Ahn et al[11]证实，HtrA在S.mutans的遗传转化中起着控制生长和反应能力的重要作用。敲除HtrA基因的S.mutans对承受低温和高温，低pH值以及氧化剂和DNA破坏剂的能力降低[5]。HtrA基因的缺失导致S.mutans在37 ℃时缓慢生长，在42 ℃耐热性降低[11]。有研究[12]表明HtrA基因的缺失可以限制细菌的存活能力，在酸性环境下，HtrA突变体的生长速度比野生株大大降低。本实验显示两实验组S.mutans生化鉴定结果与标准株S.mutans相符,说明了HtrA基因并不会对的S.mutans生物学特性和遗传特性造成严重影响。而在体外非应激条件下，两实验组S.mutans菌株的生长曲线趋势与UA159标准株虽然基本一致，但在4 h以后，HtrA高毒力株组与UA159标准株组的菌液浓度均高于HtrA基因缺陷株组，这说明HtrA基因可能并不影响乳牙S.mutans生长的基本趋势，但HtrA基因的缺失会使S.mutans的生长增殖速度降低。实验中扫描电镜下观察到各菌株的生物膜：HtrA高毒力株密度最大，HtrA基因缺陷株密度最低，HtrA缺陷株的生物膜较HtrA高毒力株的生物膜显得粗糙、稀薄，这与结晶紫染色光镜下结果一致，两者相互印证HtrA基因的缺失可降低S.mutans的黏附，使其形成的生物膜松散、稀薄。细菌生物膜结晶紫半定量分析发现HtrA高毒力株生物膜的形成比HtrA基因缺陷株生物膜的形成快且多，差异有统计学意义(P≤0.001)，说明HtrA基因的缺失会减缓S.mutans生物膜的形成速度。综上，HtrA基因与细菌生长、应激耐受力、反应能力和生物膜的形成有关。Biswas et al[5]认为HtrA可能影响S.mutans糖酵解有关的细胞外酶从而进一步影响S.mutans生物膜的形成能力，本课题组早期研究[13]表明毒力因子GTFs蛋白和基因在乳牙S.mutansHtrA基因缺陷株中的表达高于HtrA高毒力株，但其生物学活性低于HtrA高毒力株。证实了HtrA基因在乳牙S.mutansGTFs的分泌过程中可有重要的调控作用，GTFs生物学活性的降低直接导致了细胞外葡聚糖的减少，进而减缓了S.mutans在牙面的黏附与生物膜的形成。

总之，HtrA是S.mutans生长、生物膜形成和能力发展的调控网络的组成部分，这将为临床上防龋治疗提供新的方向。