蔺焕然，史泽风，郭庆勇，孙昭宇，赵艳兵，杨德吉，姚大伟*

(1.南京农业大学 动物医学院，江苏 南京 210095；2.新疆农业大学 动物医学院，新疆 乌鲁木齐 830052)

犬巴贝斯虫是巴贝斯科(Babesiidae)、巴贝斯属(Babesia)的虫体，该寄生虫寄生于犬的红细胞内，它可以引起犬巴贝斯虫病[1]。犬巴贝斯虫病的临床表现包括发热，渐进性溶血性贫血，血红蛋白尿和脾脏肿大，严重的情况可以导致犬的死亡[2]。据报道该病在世界范围内广泛流行传播[3-5]，然而目前并没有有效的疫苗用于犬巴贝斯虫病的预防。热休克蛋白(heat shock protein，HSP)在生物界中普遍存在，并具有高度的保守性，HSP70是HSPs家族中最保守和最重要的成员之一，随着研究的不断深入发现HSP70在寄生虫感染与免疫中发挥重要的作用，并对寄生虫疫苗的研究提供新的靶标分子。HSP70是目前被重点研究的寄生虫蛋白之一[6]。HSP70可以帮助寄生虫适应新的宿主环境，作为分子伴侣与多种细胞蛋白和多肽形成复合物参与蛋白的折叠、组装，越来越多的研究表明HSP70携带抗原肽可刺激不同的免疫细胞分泌细胞因子，发挥免疫佐剂功能[7]。HSP70伴侣抗原肽可以结合MHCⅠ和MHCⅡ分子，活化CD4+TH和CTL细胞[8]。免疫HSP70 DNA疫苗后可提高宿主对寄生虫感染的免疫力[9]。本研究克隆犬吉氏巴贝斯虫HSP70基因完整的开放阅读框，构建了原核表达质粒pET-32a-Hsp70，表达出重组HSP70融合蛋白，对其抗原性进行检测，为进一步研究犬吉氏巴贝斯虫血清学诊断以及巴贝斯虫基因工程亚单位疫苗的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 血液样品感染巴贝斯虫病犬血样品为本实验室保存，经PCR-RFLP、测序鉴定为犬吉氏巴贝斯虫感染[9]。

1.2 主要试剂人工感染犬吉氏巴贝斯虫病犬血清和pET-32a(+)质粒本实验室保存；Rosetta-gami(DE3)pLyS大肠杆菌购自天根生化科技(北京)有限公司；HRP标记羊抗鼠二抗购自南京生兴生物技术有限公司；HRP-兔抗犬二抗购自北京索莱宝科技有限公司；PrimeSTAR Max Premix购自宝生物工程(大连)有限公司；HRP底物Pierce ECL Substrate和蛋白检测试剂盒PierceTMBCA Protein Assay Kit购自Thermo Fisher scientific公司。

1.3 血液基因组DNA提取取100 μL抗凝血，加入400 μL裂解液，采用蛋白酶K消化和苯酚抽提的方法提取血液中总的基因组DNA[10]，50 μL TE缓冲液溶解DNA后于-20℃保存备用。

1.4 犬吉氏巴贝斯虫HSP70基因扩增参考TERKAWI等[11]所述的方法进行犬吉氏巴贝斯虫HSP70基因扩增，上游引物序列为hsp70-F 5′-ccggaattcggctcaggaacaggcaaagtt-3′，下游引物序列为hsp70-R 5′-actctcgagaagcagttt acagctcgtcac-3′，该引物能够扩增出约1 950 bp的犬吉氏巴贝斯虫HSP70基因片段。PCR反应体系如下：PrimeSTAR Max Premix 12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)0.5 μL，DNA模板5 μL 补水至25 μL。PCR扩增条件如下：95℃ 预变性5 min；95℃ 变性15 s，56℃退火15 s，72℃延伸90 s，重复30个循环；72℃ 延伸10 min。PCR产物在含有Goldview的1%琼脂糖凝胶中进行电泳，检测目的条带。

1.5 原核表达质粒的构建、表达与纯化采用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化HSP70基因片段，纯化后的PCR产物和pET-32a(+)分别经EcoRⅠ 和XhoⅠ双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，用T4DNA连接酶连接，构建重组质粒pET-32a(+)-hsp70。将重组质粒转化入Rosetta-gami(DE3)pLyS宿主菌中。挑选阳性克隆进行PCR鉴定，送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，利用 DNAStar软件包中的Seqman拼接序列，采用在线软件http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi对比分析。

阳性克隆接种LB培养基中37℃剧烈振荡至菌液D600值约为0.6，加入终浓度0.1 mmol/L的IPTG，收集不同时间点菌液1 mL，同时收集未诱导的菌液作为阴性对照。菌液处理后进行SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝染色分析。

根据筛选表达时间和诱导剂浓度进行扩大培养。诱导表达菌液离心弃上清液后，用PBS液重悬后置于-20℃冰箱中，反复冻融3次，超声破碎菌体(工作3 s，间歇3 s)，重复破碎1次。破碎后的菌液经12 000 r/min离心15 min，分别收集上清液和沉淀，经SDS-PAGE凝胶电泳，判断表达产物存在形式。将其表达产物按照His-trap纯化柱说明进行纯化，采用BCA蛋白检测。

1.6 多抗血清的制备4周龄的雌性昆明白小鼠随机分为2组，免疫组和对照组。初次免疫用150 μL纯化好的HSP70重组蛋白(0.5 g/L)与等体积的弗氏完全佐剂充分混匀乳化后，进行背部皮下多点注射。加强免疫在14，28，42 d进行，用100 μL重组蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀乳化后进行腹腔注射。对照组注射生理盐水。每次免疫前均进行尾静脉采血，分离血清，-20℃保存备用。

1.7 重组HSP70蛋白的抗原性分析将纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，经过转印，脱脂奶粉封闭，分别加入2% BSA稀释的1∶250的小鼠抗血清、1∶50的人工感染犬吉氏巴贝斯虫病犬血清、1∶50的健康犬血清作为阴性对照组、2% 的BSA作为空白对照组，4℃过夜，用PBST冲洗之后加入1∶5 000稀释HRP-羊抗鼠二抗或HRP-兔抗狗二抗，室温下轻摇孵育2 h，用PBST冲洗之后进行ECL显色，ChemiDoc XRS+成像系统拍照观察结果。

2 结果

2.1 犬吉氏巴贝斯虫HSP70基因扩增提取基因组DNA，对吉氏巴贝斯虫HSP70基因进行PCR扩增，结果如图1所示，该样品能扩增出1 950 bp的目的条带，与理论设计值相符合。

图1 Hsp70基因PCR扩增结果 1．HSP70；2：阴性对照；M.DL5000 DNA Marker

2.2 pET-32a(+)-hsp70重组质粒构建及重组蛋白的表达对通过双酶切构建重组质粒pET-32a-hsp 70，转化大肠杆菌BL21挑选阳性克隆进行鉴定，采用hsp70-F/R引物仍能从重组质粒中扩增出1 950 bp的基因片段，说明HSP70基因片段已插入到pET-32a质粒中，进一步测序结果显示pET-32a-hsp70构建成功，含有1 917 bp大小的HSP70基因片段，编码639个氨基酸，蛋白相对分子质量为70 000。如图2所示南京分离株NJN1与GenBank中日本分离NRCPD株(AB440627)氨基酸同源性为98%，有12个氨基酸插入(36Val、37Glu、Ins、Ser、Tyr、Cys、Ser、Arg、Leu、Leu、His、Pro、Val、Ala和Val)，3个氨基酸变异(Phe373Ser、Pro375Arg、Tyr376Ile)。

图2 HSP70氨基酸序列比较分析 NJN1.南京分离株；NRCPD.日本分离株

对含有重组表达质粒pET-32a-hsp70的大肠杆菌利用IPTG诱导表达，表达出约88 000重组融合蛋白，其中含有18 000的pET-32a载体蛋白，70 000 HSP70成熟蛋白。对蛋白表达条件优化发现融合蛋白在1.0 mmol/L IPTG诱导6 h时蛋白表达量最大，蛋白在包涵体和上清中都存在，在上清中表达量较高(图3)。

2.3 重组蛋白免疫原性Western blot分析Western blot结果显示，纯化后的重组蛋白SDS-PAGE电泳及转印后，采用重组蛋白免疫的小鼠抗血清作为一抗，在约88 000处有1阳性条带，采用人工感染犬吉氏巴贝斯虫病犬血清作为一抗，在约88 000处也有1阳性条带，以健康犬血清作为阴性对照未检测到条带。说明重组蛋白免疫小鼠后可以产生抗体，重组蛋白也能被天然抗血清所识别，具有较好的免疫原性和反应原性。

图3 重组HSP70蛋白表达 1.蛋白Marker；2.超声破碎后包涵体；3.超声破碎后上清；4.菌体总蛋白；5.未诱导菌体总蛋白

图4 重组蛋白的抗原性Western blot分析 M.蛋白Marker；1.重组蛋白+免疫小鼠血清；2.重组蛋白+人工感染巴贝斯虫病犬血清；3.重组蛋白+健康犬血清

3 讨论

自从吕文祥等[12]发现河南地区猎犬感染吉氏巴贝斯虫以来，犬巴贝斯虫感染在我国大部分地区都有流行的报道，前期流行的虫体主要为犬吉氏巴贝斯虫[13-14]，直到2011年有了关于犬巴贝斯虫(韦氏巴贝斯虫亚种)在广东地区流行的报道[15]。当前对于该病的治疗主要是通过深部肌肉注射三氮脒，对杀灭虫体具有一定的效果，然而近年来三氮脒治疗犬巴贝斯虫病的效果越来越差，而且病情反复，治疗周期较长[16]。对于犬巴贝斯虫的预防目前没有商品化疫苗用。由于体内、体外培养，寄生虫血症水平通常较低，采用寄生虫裂解产物作为抗原很难大规模应用于疫苗开发，因此疫苗开发的研究热点主要集中于重组巴贝斯虫抗原的筛选，主要包括BgP50、BgP29、HSP70、Glutamic acid-rich protein 和Ribosomal phosphoriboprotein P0等[17]。寄生虫感染过程中，宿主与寄生虫均处于应激状态，各自产生相应的HSPs作为对抗，虫体HSPs参与虫体分化，增强虫体毒力，逃避宿主免疫。虫体HSP可作为主要蛋白抗原，诱导宿主产生抗HSP的抗体，免疫杀伤寄生虫，种特异性HSP还可以诊断、虫种鉴定和疫苗候选抗原[18]。本研究从吉氏巴贝斯虫病犬血液中提取DNA，克隆HSP70基因并进行测序分析，结果显示本研究南京分离株HSP70与日本分离株NRCPD氨基酸相似性为98%，有12个氨基酸插入和3个氨基酸突变，在IPTG的诱导下能够表达出约88 000的融合蛋白，HSP70蛋白70 000。说明12个氨基酸的插入和3个氨基酸的突变未导致氨基酸密码子移位或提前终止现象，仍能翻译出完整的HSP70蛋白。研究发现犬吉氏巴贝斯虫在体外40℃孵育1 h后HSP70表达量显著升高，说明HSP70具有一定的抗热应激功能[11]。而且重组HSP70蛋白免疫小鼠可以刺激机体产生高水平抗体，同时显著降低小鼠外周血寄生虫血症水平[11]。本试验也证明，重组HSP70蛋白可以诱导小鼠产生相应的抗体，具有较好免疫原性，而且重组HSP70蛋白也可以与病犬产生的天然抗血清反应，具有较好的反应原性，可为犬吉氏巴贝斯虫的血清学诊断提供诊断抗原，同时HSP70也可以为犬吉氏巴贝斯虫疫苗的开发提供新的靶抗原，具有广泛的应用前景。