王孟月，吴 芃，程 艺，田 辉，张素玲，王彦伟，李向东，逄文强，田克恭

(国家兽用药品工程技术研究中心，河南 洛阳 471000)

禽呼肠孤病毒(avian reovirus，ARV)属于呼肠孤病毒科，正呼肠孤病毒属，可感染多种禽类，如鸡、火鸡、鸭和鹅等，并与多种疾病有关，感染途径为肠道或呼吸道[1]。主要包括病毒性关节炎/腱鞘炎、矮小综合征、呼吸道疾病、肠道疾病、免疫抑制和吸收不良综合征等。感染引起的病症很大程度上取决于宿主年龄、免疫状态、病毒的致病型及感染途径。目前，研究最多的疾病是病毒性关节炎[2]。

ARV具有典型的呼肠孤病毒形态，无囊膜，呈二十面体对称的双层衣壳结构，其核酸由双层蛋白质衣壳所包裹[3]。基因组为双链RNA，可分为10个片段，根据各个节段核酸电泳迁移率的不同，可以分为L(L1、L2、L3)、M(M1、M2、M3)和S(S1、S2、S3、S4)3组[4]。

ARV至少有10个不同的结构蛋白，其中8个是mRNAs的主要翻译产物(λA、λB、λC、μA、μB、σA、σB、σC)，另外2个μBN和μBC由前体蛋白μB经翻译后裂解形成。其中，λA形成内部核衣壳(inner core shell)，包围着10个病毒基因组片段、病毒RNA聚合酶λB以及辅助因子μA；σA位于λA顶部，充当内部衣壳和外层衣壳之间的桥梁，起到稳定衣壳的作用；五聚体λC从内部核心延伸到外衣壳表面形成一座“炮塔”(turret)，细胞黏附蛋白σC从“炮塔”顶端向外突出；再加上由μB和σB形成的外层衣壳(outer shell)，形成完整的ARV结构[5]。

σC由S1基因第3个ORF编码，是一个只有326个氨基酸的相对较小的蛋白，与病毒型特异性中和反应表面抗原有关，能够刺激机体产生保护性中和抗体，并且σC蛋白与病毒的吸附、增殖和合胞体的形成有关[6-7]。文献研究显示σC具有同型三聚体结构，每个单体包括两个功能域：C端的头部区(knob)和N端的轴部区(shaft)[8]。C端的knob区可能是σC基因刺激机体产生保护性中和抗体的主要功能区域，为了证实σC基因具体的有效功能域，本试验截取σC基因C端头部区和部分轴部区，构建包含其不同功能域的原核表达载体，在大肠杆菌表达系统中高效表达σC及其截短蛋白。

大肠杆菌作为革兰阴性菌细胞壁中存在大量内毒素，在重组蛋白中存在少量的内毒素就能引起机体明显副反应，因此，对于兽用疫苗，内毒素的去除就变得非常重要[9]。Triton系列表面活性剂在水溶液中表现出一种溶混性间隔，超过临界(也被称为浊点)温度后，胶束聚集成水分含量极少的液滴，进而形成一种新相，而内毒素保留在富含表面活性剂的相中，通过离心或者持续增加温度，两相将分离，并且富含表面活性剂的一相位于整个体系的底部。该过程可重复直至残留内毒素浓度低于阈值为止。Triton X-114的浊点为22℃，有利于蛋白纯化[10]。有文献显示利用Triton X-114可以有效地去除蛋白溶液中的大部分内毒素，并且不损害蛋白质的正常功能[11]。

本研究利用温度调控相变的Triton X-114双水相萃取方法降低了大肠杆菌重组表达σC及其截短蛋白中残留的内毒素含量，随后通过无机盐多步蛋白沉淀工艺去除样品中残留的Triton X-114，并对蛋白进行初步纯化，获得内毒素残留量较低的纯净蛋白样品。比较不同重组蛋白免疫SPF鸡后，针对ARV的抗体产生情况，结果显示σC及其截短蛋白具有良好的反应原性，为ARV新型诊断试剂和亚单位疫苗的研发奠定基础，并为σC功能域分析提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 菌株和载体pUC57-σC(含有σC开放阅读框，经大肠杆菌密码子优化)质粒由本实验室构建；菌株DH5α，E.ColiBL21(DE3)购自天根生物；鸡源抗ARV的多克隆血清由本实验室制备并保存；ELISA试剂盒检测S/P达到14(S/P>0.2)判定为阳性；pET-28a(+)质粒购自Novagen。

1.2 主要试剂及试剂盒限制性内切酶、T4DNA连接酶购自Thermo Fisher；2×TransStart FastPfu PCR SuperMix试剂盒购自全式金；DNA 胶回收试剂盒购自OMEGA公司；质粒提取试剂盒购自天根生物；PageRuler Plus Prestained Protein Ladder购自Thermo Fisher；抗鸡 IgG-HRP二抗购自Therm；ARV抗体检测试剂盒购自IDEXX公司；Ni Sepharose 6Fast Flow购自美国GE Healthcare；凝胶法鲎试剂盒购自厦门鲎试剂生物科技股份有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.3 引物设计与合成参照ARV S1133株序列(GenBank登录号：AF330703)大肠杆菌密码子优化后的σC基因序列，利用Primer Premier 5.0软件，设计引物,σC-F：CGCGGATCCATGGCTGGTCTGAACCCGTC；σC-122-F：5′- CGCGGATCCGAC-GGTAACTCTACCGCTA-3；σC-156-F：5′- CGCGGATCCTCTCACGGTCTGTCTTTCTCT-3′；σC-192-F：5′- CGCGGATCCTCTGCTGAAGCTCAG-CTG-3′；σC-R：5′- CCGGAATTCTTAGGTGTC-GATACCGGT-3′，上下游引物5′端斜体下划线部分分别设计有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。引物由苏州金唯智生物股份有限公司(GENEWIZ)合成。

1.4 表达菌株的构建以pUC57-σC为模板，σC-F、σC-122-F、σC-156-F和σC-192-F分别作为上游引物，σC-R作为下游引物，利用全式金2×TransStart FastPfu PCR SuperMix进行σC基因及其不同截短片段(1～326，122～326，156～326和192～326位氨基酸残基)目的基因扩增。PCR反应体系如下(50 μL)：ddH2O 22 μL，2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 25 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板1 μL。反应条件：95℃ 2 min；95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，共30个循环；最后72℃延伸5 min。扩增目的DNA条带进行胶回收，经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切消化后得到的片段，与经过相同的酶切的pET-28a(+)载体连接，将连接好的质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含卡那霉素的LB平板，37℃静置培养10～12 h，直至单菌落清晰可辨，挑取单菌落提取质粒，对其进行双酶切鉴定和测序验证，正确质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，即为能表达ARV σC、σC-122、σC-156和σC-192蛋白的工程菌E.coliBL21(ED3)/pET-28a(+)-σC、σC-122、σC-156和σC-192菌株。

1.5 σC重组蛋白诱导表达挑取E.coliBL21单个菌落至含有卡那霉素(50 mg/L)的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。将过夜培养的菌液按照1%接种于含有卡那霉素的LB培养液中，37℃、220 r/min培养至D600值为0.5～0.6时，用0.5 mmol/L的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)于28℃继续培养8 h诱导蛋白表达。

1.6 Western blot鉴定σC截短蛋白的表达离心收集诱导表达后的菌体细胞，按照菌体：重悬液=1∶10的比例加入PBS，充分重悬菌体细胞。超声破碎后，4℃、12 000 r/min 离心30 min，收集上清。破碎上清经过SDS-PAGE电泳后，采用半干法将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入1∶500鸡源抗ARV多克隆血清，4℃孵育过夜。PBST洗涤3次，每次5 min。最后加入1∶5 000 HRP标记的兔抗鸡IgG，室温孵育1 h，PBST洗涤3次，每次5 min。DAB显色试剂盒显色后，观察结果。

1.7 蛋白纯化分别取pET-28a(+)-σC/122/156/192转化的E.ColiBL21(DE3)诱导后的菌体加PBS重悬后，高压均质机800 bar循环破碎3次。破碎液4℃，12 000 r /min 离心10 min，收集上清。4组破碎上清于4℃条件下分别加入终浓度为0.5% Triton X-114，强力涡旋混匀。4℃静置10 min，立即放入37℃水浴升温直至Triton X-114胶束聚集成水分含量极少的液滴，进而形成一种新相，室温12 000 r /min 离心10 min，收集上清。上述Triton X-114处理过程重复3次，收集处理后上清，加入硫酸铵直至饱和度达到30%，4℃搅拌沉淀30 min，4℃ 12 000 r /min 离心10 min，收集上清。加入硫酸铵使其饱和度提升至50%，4℃搅拌沉淀30 min，4℃ 12 000 r /min 离心10 min，收集沉淀，用PBS原倍重悬，并参照凝胶法鲎试剂盒说明书检测处理前后蛋白样品中内毒素残留量。前处理后的重悬蛋白样品用0.45 μm孔径滤膜过滤后，利用Ni SepharoseTM6 Fast Flow镍柱进行层析纯化。收集的洗脱蛋白进行SDS-PAGE电泳检测。

1.8 重组蛋白免疫原性研究纯化后的目的蛋白，用BCA法进行定量，按照水相∶油相(1∶2)乳化制备疫苗。将21日龄的SPF鸡随机分为6组(A～F，10只/组)，A～D组分别免疫σC/122/156/192重组蛋白，免疫剂量均为50 μg/只，肌肉注射；E组免疫商品化灭活全病毒疫苗，作为阳性对照；F组接种无菌PBS，作为空白对照。免疫后28 d翅静脉采血，分离血清，用IDEXX ARV抗体检测试剂盒进行抗体检测。

2 结果

2.1 σC及其截短基因的扩增以pUC57-σC为模板，用σC-F、σC-122-F、σC-156-F和σC-192-F分别作为上游引物，σC-R作为下游引物，经过PCR扩增获得与预期大小相符的σC(999 bp)、σC-122(636 bp)、σC-156(531 bp)和σC-192(426 bp)基因片段(图1)。

图1 目的基因PCR产物电泳结果 M.DL2000 DNA Marker;1.σC;2.σC-122;3.σC-156;4.σC-192

2.2 重组质粒的构建与鉴定将扩增出的目的片段经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，与同样用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切的pET-28a(+)质粒进行连接，对构建好的重组质粒pET-28a(+)-σC/122/156/192分别进行酶切，酶切产物经电泳后分别获得2条条带，1条为5 369 bp的质粒pET-28a(+)条带，另1条依次为σC(999 bp)、σC-122(636 bp)、σC-156(531 bp)和σC-192(426 bp)基因条带(图2)。并对重组质粒多克隆区进行测序，序列对比结果显示与模板一致。

图2 重组质粒双酶切鉴定电泳结果 M.DL5000 DNA Marker；1.空载pET-28a(+)；2.重组质粒pET-28a(+)-σC；3.重组质粒pET-28a(+)-σC-122；4.重组质粒pET-28a(+)-σC-156；5.重组质粒pET-28a(+)-σC-192

2.3 Western blot鉴定重组蛋白表达诱导表达后的σC、σC-122、σC-156和σC-192破碎上清分别经免疫印迹试验与鸡源抗ARV多克隆血清反应，结果显示分别于37 000，25 000，22 000和18 000附近出现明显特异性条带(图3)，表明σC、σC-122、σC-156和σC-192蛋白在大肠杆菌中获得可溶性正确表达，且表达的σC相关重组蛋白具有良好的反应活性。

图3 Western blot鉴定重组蛋白表达 M.预染蛋白质Marker；1.σC重组蛋白破碎上清；2.σC-122重组蛋白破碎上清；3.σC-156重组蛋白破碎上清；4.σC-192重组蛋白破碎上清

2.4 重组蛋白的纯化重组构建的σC、σC-122、σC-156和σC-192蛋白利用温度调控相变的Triton X-114双水相萃取，与无机盐硫酸铵分级蛋白盐析沉淀相结合的纯化工艺进行前处理，处理前后的蛋白样品分别用凝胶法鲎试剂盒检测内毒素残留量，结果显示经过前处理，蛋白样品中内毒素残留量从500 000降到1 000 EU/mL以下。随后将前处理后的蛋白样品进行镍柱层析，以提高蛋白纯度，纯化后的蛋白样品经过12% SDS-PAGE电泳(图4)，结果显示，4组蛋白通过镍柱亲和层析进行纯化后获得的蛋白除σC之外纯度均可达到80%～90%。

图4 纯化后重组蛋白SDS-PAGE分析 M．预染蛋白质Marker；1.纯化后σC蛋白；2.纯化后σC-122蛋白；3.纯化后σC-156蛋白；4.纯化后σC-192蛋白

2.5 重组蛋白免疫原性研究免疫后观察14 d，免疫鸡精神、饮食及注射部位均无异常，免疫后14 d检查注射部位，无硬结、脓肿和溃烂等不良反应。SPF鸡的抗体检测结果显示，σC蛋白免后28 d抗体阳性比例为8/10，σC-122、σC-156和σC-192蛋白免疫组均为4/10，阳性对照组抗体阳性比例为9/10，空白对照组为0/10。结果表明，σC-122、σC-156和σC-192免疫后诱导产生少量抗体；σC重组蛋白具有较高的免疫原性，抗体阳性比例与全病毒灭活苗接近(表1)。

表1 免疫后抗体阳性率

3 讨论

免疫接种是预防ARV的主要方法，目前，已经有弱毒活疫苗和灭活疫苗用于预防鸡病毒性关节炎，基本控制了ARV流行。ARV灭活疫苗安全无副作用，不足之处是使用剂量大；和灭活疫苗相比，弱毒活疫苗诱导的免疫反应持续时间更长，但弱毒株免疫存在一定安全隐患[12]。因此，开发研究一种不含核酸成分、不具有复制能力安全有效的亚单位疫苗具有重要的应用价值。

σC蛋白是ARV的主要蛋白，位于病毒的外壳，含有病毒型特异性中和表面抗原，与病毒吸附、增殖和合胞体形成有关，能够提高病毒感染细胞的能力，在ARV感染和致病机制上有重要作用。根据文献报道情况，大部分ARV亚单位疫苗研发都以σC蛋白为靶标[13]。大肠杆菌因其遗传背景清楚且有益于培养等优点，适用于蛋白重组表达[14]。但文献报道显示，用大肠杆菌表达全长σC难度较大，多为包涵体形式存在[15]，而包涵体复性的回收率较低，复性结果不可预期。

本研究根据σC功能域：C端头部区(knob)和N端轴部区(shaft)，对其进行截短：构建包含其不同功能域的原核表达质粒，在大肠杆菌表达系统中高效表达了σC及其截短蛋白，Western blot结果显示，重组σC及其截短蛋白能够被抗ARV高免血清识别，证明本研究用大肠杆菌表达的σC及其截短蛋白具有较高的反应活性。本研究通过温度调控相变的双水相萃取与无机盐多步蛋白盐析沉淀的纯化工艺，对σC及其截短蛋白进行前处理纯化，前处理后的蛋白样品内毒素残留量从500 000降到1 000 EU/mL以下，去除了重组蛋白中99%以上的内毒素，符合禽用大肠杆菌源亚单位疫苗的质量安全标准。将纯化后的σC及其截短蛋白分别免疫SPF鸡，比较不同重组蛋白免疫后针对ARV诱导抗体产生情况，结果显示接种部位无硬结、脓肿和溃烂等不良反应发生，表明该纯化方法能够有效降低大肠杆菌表达重组蛋白中残留内毒素造成的副反应。σC-122、σC-156和σC-192免疫后诱导产生少量抗体，抗体阳性比例为4/10，σC免疫原性较高，免疫后抗体阳性比例与灭活全病毒类似，截短片段诱导抗体产生的能力较差。很多文献报道表明，自然状态下σC是一个同源三聚体，而σC的聚集状态又影响其细胞黏附作用[16-17]，因此推测不同大小截短片段的免疫原性差异，可能归结于σC截短表达影响了其结构，导致不能形成三聚体进而降低了重组蛋白的免疫原性。尽管σC截短重组蛋白作为亚单位疫苗候选可能存在一定问题，基于σC-122等在大肠杆菌中较高的可溶性表达量，能够被抗ARV高免血清识别，因此可以作为ARV新型诊断试剂候选。本研究结果提示，在大肠杆菌表达系统中以σC蛋白为靶标进行ARV亚单位疫苗研发时，重点可能在于保持σC完整性与三聚化状态的同时，增加其可溶性表达方法的摸索。