李辉，刘登湘，韩翠平

（邢台市人民医院 1. 肝胆外科，2. 放疗科，3. CT 室，河北 邢台 054031）

肝癌是临床常见的恶性肿瘤之一，具有恶性程度高、进展迅速、高病死率等特点，在恶性肿瘤中，肝癌的病死率居第2 位[1]。随着医疗条件的改善，肝癌患者生存率得到较大幅度的提高，但是其高转移率和高复发率成为肿瘤治疗的最大障碍[2]。癌细胞转移过程是多基因参与调控的复杂过程，该过程涉及基因的异常表达和相关信号传导通路的异常激活[3]。虫草素即3'- 脱氧腺苷，是北冬虫夏草和冬虫夏草的主要活性成分。虫草素具有广泛的药理作用，如抑菌、抑制蛋白激酶活性、抑制病毒等[4-5]。研究显示，虫草素能通过激活AMPK 信号通路抑制耐药性非小细胞肺癌进展[6]。还有文献报道，虫草素可通过激活AMPK 和抑制AKT 信号通路增强胶质瘤细胞对替莫唑胺的化学敏感性。提示虫草素具有抗肿瘤作用[7]。本文观察虫草素对肝癌细胞迁移和侵袭的影响，并对其作用机制进行探讨，为肝癌的治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器

人肝癌细胞株Bel-7402 购自中国科学院上海细胞库。胰酶、胎牛血清（FBS）和RPMI 1640 培养基（美国Gibco 公司），甲基噻唑基四唑（MTT）和虫草素（美国Sigma 公司），二甲基亚砜（DMSO）（国药集团），GAPDH、ERK、p-ERK、EGFR、p-EGFR、MMP-2 和MMP-9 抗体（美国CST 公司），聚合酶链反应引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成，SYBY Green PCR Kit（大连TaKaRa 公司），Infinite M200 酶标仪（美国Tecan 公司），GE-680 凝胶成像仪（美国Bio-Rad 公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 MTT 法检测虫草素对细胞活力的影响取对数生长期的模型细胞，以每孔7×103个细胞接种于96 孔板中。待细胞贴壁后加入不同浓度的虫草素（0、20、40、80、160、320 和640 µmol/L），设置空白对照组，加入培养液和二甲亚砜（DMSM），每组设置5 个重复孔，置于37℃、5% 二氧化碳培养箱中继续培养，虫草素作用48 h 后每孔加入MTT 溶液（5 g/L）10 µl，二氧化碳培养箱继续培养3 ～4 h 后，每孔加入100 µl DMSO 溶液，37℃震荡20 min 后用酶标仪检测波长570 nm 处的吸光度（OD）值，并计算肝癌细胞Bel-7402 的存活率。细胞活力=（OD加药组-OD空白对照组）/OD空白对照组×100%。

1.2.2 划痕实验检测细胞迁移能力取生长状态良好的模型细胞用胰酶消化成单细胞悬液后，以每孔2×105个细胞接种于6 孔板中（6 孔板背面划好标记线），待细胞密度接近90% 时弃掉培养基，用无菌10 µl 枪头垂直于标记线划痕，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗去脱落和状态不良的细胞，加入虫草素（40和80 µmol/L），并设置空白对照组，置于二氧化碳培养箱中继续培养48 h 后，用倒置显微镜拍照，在0 和48 h 下各取4 个视野拍照，实验重复3 次。

1.2.3 侵袭小室实验检测细胞侵袭能力提前稀释好Matrigel 胶，取150 µl 加入侵袭小室中，37℃培养箱中孵育50 min。用含0.1% FBS 的RPMI 1640 培养基将细胞制备成单细胞悬液1×108～1×109个/L。侵袭小室上室每孔加入200 µl 细胞悬液，下室中加入800 µl 含有30% FBS 的RPMI 1640 培养基，并于上下室中加入终浓度为40 和80 µmol/L 的虫草素，置于37℃、5% 二氧化碳培养箱中继续培养48 h 后用镊子取出小室，PBS 漂洗后用棉签轻轻擦去残留的细胞碎片，放于通风处风干。置于含有0.1% 结晶紫的甲醇溶液中染色25 min，PBS 漂洗干净并风干。显微镜下观察膜底细胞数目并进行拍照统计。显微镜记录5 个视野中细胞数目，每个实验设置2 个复孔，实验重复3 次。

1.2.4 qRT-PCR 检 测MMP-2 和MMP-9 mRNA表达水平取对数生长期的模型细胞接种于6 孔板中，待长至70% 密度时加入虫草素（40 和80 µmol/L）作用48 h，并以等体积溶剂处理作为空白对照组。48 h后提取总RNA，提取的总RNA 按Prime ScriptTMRT Master Mix 试剂盒说明书逆转录合成cDNA。合成的cDNA 按照SYBY Green PCR Kit 试剂盒说明书进行qRT-PCR 反应，每个浓度下的cDNA 设置3 个重复孔，每次实验重复3 次。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.2.5Western blotting 实验检测MMP-2 和MMP-9蛋白表达将模型细胞接种于6 孔板中，待细胞贴壁达70% 密度时加入40 和80 µmol/L 的虫草素作用48 h，并以等体积溶剂处理作为空白对照组。48 h 后弃培养基用预冷的PBS 洗2、3 次；细胞刮将细胞刮下收集至离心管，于提前预冷的4℃离心机2 500 r/min，离心5 min ；弃掉PBS，根据细胞含量加入适量蛋白裂解液，冰上裂解10 min，每2 分钟涡旋1 次；12 500 r/min，离心20 min ；取上清液置于新的离心管中，BCA 法检测蛋白含量；加入5× 上样缓冲液涡旋混匀并离心，沸水浴变性10 min。12% 聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转移到PVDF 膜上，5% 脱脂牛奶封闭后，加入一抗，室温孵育2 h 回收一抗，TBST 洗膜3 次，用含有辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育2 h，TBST 洗膜3 次，10 min/ 次，于凝胶成像系统中拍照并进行灰度值计算。

1.3 统计学方法

数据分析采用Graphpad Prism 5.0 软件，计量资料以均数± 标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 虫草素对模型细胞细胞活力的影响

给 予0、20、40、80、160、320 和640 µmol/L虫草素处理48 h 后，MTT 法检测结果显示，不同浓度虫草素作用下模型细胞活力为（100.00±0.00）%、（98.16±3.18）%、（97.48±8.46）%、（95.64±7.36）%、（90.14±10.17）%、（62.13±10.42）% 和（44.82±11.63）%，各组细胞活力比较，差异有统计学意义（F=34.090，P=0.000）。0 ～80 µmol/L 虫草素对细胞活力无明显影响；而80 ～640 µmol/L 时，细胞活力下降；与0 µmol/L 比较，320 和640 µmol/L 时细胞活力显著下降（t=8.117 和10.599，均P=0.000）。见图1。

图1 虫草素对Bel-7402 细胞活力的影响

2.2 虫草素抑制模型细胞迁移和侵袭

划痕实验结果显示，空白对照组，40 和80 µmol/L虫草素对细胞迁移的抑制率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），与空白对照组比较，40 和80 µmol/L 虫草素均能抑制细胞的迁移（t=12.692、18.448，均P=0.000）（见表2 和图2）。侵袭小室实验结果显示，空白对照组，40 和80 µmol/L 虫草素对细胞侵袭的侵袭率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），与空白对照组比较，40 和80 µmol/L 虫草素均能抑制细胞的侵袭（t=6.055 和3.422，均P=0.000）（见表2 和图3）。

表2 不同浓度虫草素对模型细胞迁移和侵袭的影响（%，±s）

表2 不同浓度虫草素对模型细胞迁移和侵袭的影响（%，±s）

注：与空白对照组比较，P ＜0.05。

组别 细胞迁移 细胞侵袭空白对照组 92.54±3.28 100.00±23.48 40 µmol/L 组 51.67±6.41† 35.66±3.65†80 µmol/L 组 49.67±4.03† 62.45±7.12†F 值 128.959 25.463 P 值 0.000 0.000

图2 虫草素对细胞迁移能力的影响

图3 虫草素对细胞侵袭能力的影响

2.3 虫草素抑制MMP-2、MMP-9 mRNA 和蛋白表达

RT-qPCR 和Western blotting 结果显示，空白对照组，40 µmol/L 组、80 µmol/L 组处理虫草素48 h后MMP-2 mRNA 表达差异有统计学意义（P＜0.05），空白对照组与40 µmol/L 组、80 µmol/L 组比较，差异有统计学意义（t=7.462 和15.125，均P=0.000），40 µmol/L 与80 µmol/L 组比较，差异有统计学意义（t=4.939，P=0.001）；空白对照组，40 µmol/L组、80 µmol/L 组虫草素处理48 h 后MMP-9 mRNA表达差异有统计学意义（P＜0.05），空白对照组与40 µmol/L 组、80 µmol/L 组比较，差异有统计学意义（t=6.250 和17.488，均P=0.000），40 µmol/L 组与80 µmol/L 组比较，差异有统计学意义（t=3.059，P=0.016）。见表3 和图4。

表3 不同浓度虫草素对MMP-2、MMP-9 mRNA 表达水平的影响 （±s）

表3 不同浓度虫草素对MMP-2、MMP-9 mRNA 表达水平的影响 （±s）

注：①与空白对照组比较，P ＜0.05；②与40 µmol/L 组比较，P ＜0.05。

组别 MMP-2 mRNA MMP-9 mRNA空白对照组 100.00±0.00 100.00±0.00 40 µmol/L 组 62.42±11.25① 51.18±17.46①80 µmol/L 组 28.29±10.59①② 23.82±9.75①②F 值 80.761 55.823 P 值 0.000 0.000

图4 虫草素抑制MMP-2、MMP-9 mRNA 和蛋白表达水平

空白对照组，40 µmol/L 组、80 µmol/L 组虫草素处理48 h 后MMP-2 蛋白表达差异有统计学意义（P＜0.05），空白对照组与40 µmol/L 组、80 µmol/L 组比较，差异有统计学意义（t=7.608 和33.740，均P=0.000），40 µmol/L 组与80 µmol/L 组比较，差异有统计 学 意 义（t=6.381，P=0.000）；空 白 对 照 组，40 µmol/L 组、80 µmol/L 组 虫 草 素 处 理48 h 后MMP-9 蛋白表达差异有统计学意义（P＜0.05），空白对照组与40 µmol/L 组、80 µmol/L 组比较， 差异有统计学意义（t=6.393 和31.290，均P=0.000），40 µmol/L 组与80 µmol/L 组比较，差异有统计学意义（t=4.762，P=0.000）。见表4 和图4。

2.4 虫草素抑制p-ERK 和p-EGFR 蛋白表达

Western blotting 结果显示，空白对照组，40 µmol/L组、80 µmol/L 组虫草素处理48 h 后p-ERK 表达差异有统计学意义（P＜0.05），空白对照组与40 µmol/L组、80 µmol/L 组比较，差异有统计学意义（t=7.219和25.273，均P=0.000），40 µmol/L 组与80 µmol/L 组比较，差异有统计学意义（t=7.459，P=0.000）；空白对照组、40 µmol/L 组、80 µmol/L 组虫草素处理48 h后p-EGFR 表达差异有统计学意义（P＜0.05），空白对照组与40 µmol/L 组、80 µmol/L 组比较，差异有统计学意义（t=16.998 和52.212，均P=0.000），40 µmol/L组与80 µmol/L 组比较，差异有统计学意义（t=9.247，P=0.000）。见表5 和图5。

表5 各组p-ERK、p-EGFR 蛋白表达水平的比较（±s）

表5 各组p-ERK、p-EGFR 蛋白表达水平的比较（±s）

组别 p-ERK 蛋白 p-EGFR 蛋白空白对照组 100.00±0.00 100.00±0.00 40 µmol/L 组 75.46±7.54 52.49±6.23 80 µmol/L 组 45.68±4.78 23.45±3.24 F 值 138.828 451.994 P 值 0.000 0.000

表4 各组MMP-2、MMP-9 蛋白表达水平的比较 （±s）

表4 各组MMP-2、MMP-9 蛋白表达水平的比较 （±s）

注：①与空白对照组比较，P ＜0.05；②与40 µmol/L 组比较，P ＜0.05。

组别 MMP-2 蛋白 MMP-9 蛋白空白对照组 100.00±0.00 100.00±0.00 40 µmol/L 组 61.52±8.76① 67.26±8.87①80 µmol/L 组 26.37±3.78①② 41.29±3.25①②F 值 222.885 145.079 P 值 0.000 0.000

图5 虫草素抑制p-ERK 和p-EGFR 蛋白表达

3 讨论

肝癌是目前常见的恶性肿瘤，是导致人类死亡的肿瘤之一。细胞内多种信号传导通路异常是肝癌发病的主要机制。EGFR 是位于细胞膜上的一种糖蛋白受体，由3 个部分组成：膜外区、跨膜区和膜内区[8]，在各种肿瘤细胞表面EGFR 呈现高表达状态。研究发现，EGFR 特异性抑制剂AG1478 能够抑制多种肝癌细胞的增殖，这充分说明EGFR 在肝癌进展中发挥重要的作用[9]。

研究已证实，虫草素能抑制肝癌HepG2 细胞和结肠癌HCT116 细胞迁移及侵袭[10-11]。而本研究发现虫草素能抑制人肝癌Bel-7402 细胞迁移和侵袭，与上述研究结果类似。一般来说，当配体与EGFR 的膜外区结合后，细胞内的酪氨酸残基发生磷酸化，并进一步磷酸化激活下游信号传导通路，如PI3K/Akt、MAPK/ERK 等[12]。研究发现，虫草素能够抑制肝癌细胞MHCC97H 中MMP-2 和MMP-9 的表达，从而抑制细胞迁移和侵袭[13]。而MAPK 信号通路在MMP-2 和MMP-9 转录激活中发挥重要作用[14-15]，并且EGFR 参与MAPK/ERK 通路的上游调控[16]。基于上述研究，本课题组推测虫草素抑制肝癌细胞的迁移与侵袭作用可能与其抑制EGFR/ERK 信号通路有关。本研究发现，不同浓度的虫草素可以明显抑制人肝癌细胞Bel-7402迁移和侵袭，且下调MMP-2 和MMP-9 的mRNA 和蛋白表达，这与文献报道相一致。通过进一步的研究发现，虫草素可以抑制ERK 磷酸化，该作用随药物浓度增加而增强。EGFR 是ERK 的上游调控靶点，为进一步验证EGFR 是否参与其中，本研究分析虫草素与EGFR 活化的关系。结果发现，虫草素能显著抑制EGFR 磷酸化。提示虫草素可能通过EGFR/ERK 通路来调节细胞迁移和侵袭活动。

综上所述，虫草素可能通过EGFR/ERK 通路介导的MMP-2 和MMP-9 表达下调，从而调控细胞的迁移和侵袭活动。本实验初步探讨虫草素对人肝癌细胞Bel-7402 迁移和侵袭的抑制作用，将为临床肝癌的预防和治疗提供新的选择，但其具体作用机制仍需进行深入探讨研究。