张慧，王艳艳，黄莉莉，毛子玮，李廷利

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

胃炎具有病程长、复发性强的特征，给患者带来了痛苦，其发病原因与生物、药物、生理等多种因素相关。症状以恶心、腹痛、胃溃疡等常见，病理切片可见胃黏膜上皮薄、肌层增生等[1]。吴茱萸-黄连药对是治疗胃肠疾病的经典中药药对。吴茱萸和黄连药对配伍，不同比例会形成不同的配方且应用功效也不尽相同。吴茱萸与黄连药对配伍以吴茱萸为君药，配比6：1时组成反左金丸，以黄连为君药配比6：1时组成左金丸，左金丸出自《丹溪心法·火六》以泻热为主，主要针对胃肠热症疾病，肝火犯胃引起的恶心，呕逆等[2]。后人在左金丸的基础上进行改良将其比例互换得到反左金丸、甘露散、茱萸丸。反左金丸以吴茱萸作为君药，用于治疗寒凝阻滞引起的胃脘疾病，甘露散以黄连吴茱萸2∶1，主治胃热型胃肠疾病[3]，茱萸丸以黄连吴茱萸1∶1，主治虚寒型腹泻下痢等胃肠疾病[4]。这些不同比例的吴茱萸黄连配伍都具有共同的药理作用：对胃肠疾病可以抑制与胃酸分泌相关的激素以及中和胃蛋白酶等、促进胃肠蠕动还可以抗幽门螺旋杆菌防止胃溃疡发生[5-6]。

虽然吴茱萸和黄连在胃癌、胃溃疡等胃肠疾病中研究较为广泛[7-9]，临床报道吴茱萸黄连治疗胃炎有显著的疗效[10]，但是系统介绍吴茱萸-黄连药对治疗胃炎的机制研究较少，且研究靶点较为单一，故此本文基于网络药理学，对吴茱萸-黄连药对配伍治疗胃炎机制进行多靶点、多途径进行探讨，为今后更深一步研究提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

数据库TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform)、BankDrug、STITCH(Chemical Association Networks)、 Swiss Target Prediction、Uniprot、 GeneCards、OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)、TTD(Therapeutic Target Database)、HPO (Human Phenotype Ontology)、蛋白互作网络数据库String、数据库DisGeNET、基因本体论数据库Bioconductor、韦恩图安装包Venny 2.1.0、绘图安装包colorspace、stringi等、R语言软件R×64 3.6.1、软件Cytoscape 3.7.2。

1.2 方法

1.2.1 吴茱萸-黄连药对活性成分的筛选

活性成分的筛选主要为文献结合数据库TCMSP和BankDrug中查找获得。筛选成分的标准设为OB%≥30，DL≥0.18[11]。TCMSP数据库包含了499 味中草药以及其化合物约300 000个成分，它的每个化合物都提供了关于人体吸收、分布、代谢(ADME)、OB、DL等相关性质，为药物活性成分的筛选和活性成分靶点的筛选提供了较为方便的平台[7]。

1.2.2 吴茱萸-黄连药对相关靶点的筛选

在数据库TCMSP、STITCH、SwissTarget 输入吴茱萸和黄连的活性成分，筛选出活性成分的作用靶点整理并导出，去重。然后在Uniprot中的Uniprot KB数据库 Uniprot限定物种为Homo sapiens，然后再使用脚本程序将对应靶点进行注释校正为其官方名称，收集整理得到药物成分-靶点文档，备用。

1.2.3 疾病相关靶点的筛选

在数据库GeneCards、OMIM、TTD、HPO、Uniprot输入“gastritis”进行相关疾病的检索，物种限定为人类，之后将全部相关基因导出并选择相关度大于等于2的靶点，收集整理成疾病靶点文档，备用。

1.2.4 药物-成分-靶点-疾病的网络构建

使用R语言安装韦恩图安装包Venny 2.1.0将成分-靶点文档和疾病靶点文档求交集绘制成韦恩图，并得到成分-疾病文档，将药物-成分-靶点-疾病联系建立起来。之后，在软件Cytoscap 3.7.2输入相关文件，绘制药物-活性成分-靶点-疾病网络图。

1.2.5 蛋白相互作用网络构建与分析

我们检索string网站，在选项种选择多个蛋白选项，将上述关键靶点粘贴输入String数据库，物种限定为Homo sapiens，点击继续后得到蛋白互建PPI网络，得到的PPI网络图关系线适中，故对网站默认参数不进行修改，设置默认最低相互作用阀值“medium confidence”为0. 4，之后以将结果以tsv格式导出，从而得到蛋白相互作用关系PPI网络图。数据库String 能够查询已知约九百六十万蛋白之间的相互作用关系，预测蛋白与蛋白之间约十三亿八千万多种相互作用关系，为药物作用靶点的筛选提供了方便[11]，此外，该数据库还总结了实验检测、生物信息学方法预测得到的数据，为实验开展提供依据。

1.2.6 基因本体论生物学过程分析(gene ontology，GO)、KEGG通路富集分析

先将关键靶点用脚本将symbol转换为ID后，在R中进行相关安装包(colorspace，stringi)的安装后，用R语言在Bioconductor平台对关键靶点基因进行GO富集分析和KEGG通路分析。导出保存GO富集分析表格、KEGG富集分析表格，KEGG通路图[11]。

2 结果

2.1 吴茱萸-黄连药对活性成分以及靶点的筛选

在数据库TCMSP以及Bankdurg中分别输入吴茱萸和黄连，设置OB≥30%，DL≥0.18对成分进行筛选，吴茱萸筛选得29个，黄连筛选得到14个，两者共同成分有2种，分别为berberine(小檗碱)、quercetin(槲皮素)。其中，去除没有与胃炎靶点基因相对应的成分，共筛选出符合条件的23个成分，吴茱萸是17个，黄连是8个，二者相同成分2个(见表1)。然后，将活性成分在数据库TCMSP中的靶点整合得到一起，再从数据库STITCH、数据库SwissTarget 筛选相关活性成分的靶点，删除相同的靶点，共得到79个活性成分靶点。

2.2 胃炎疾病靶点的筛选

在数据库GeneCard、OMIM、TTD、HPO中输入“gastritis”，得到胃炎疾病相关靶点后，去重，选取其中相关度大于等于2的靶点，共获得233个疾病靶点。利用 R 语言安装韦恩图绘制包绘制韦恩图，获得共同基因18 个，分别为CASP3、VEGFA、EGFR、IL6、MYC、CCND1、ERBB2、PPARG、CASP8、ICAM1、PTGS1、BCL2、NFKBIA、BIRC5、GSTP1、PARP1、RASSF1、GSTM1。在数据库DisGeNET中依次输入这18个关键靶点得到关于这些靶点的相关信息(见表2)。这些靶点中CASP3、CCND1、CASP8、PTGS1、BIRC5、RASSF1，6个是属于酶类；MYC、PPARG，2个属于转录因子，其中PPARG还是一种受体；EGFR、BCL2，2个属于受体类型；VEGFA属于血管内皮生长因子；IL6属于细胞介素；以及ERBB2、ICAM1、NFKBIA、GSTP1、PARP1、GSTM1，6个未知类型的靶点基因。这些多类型的靶点基因说明吴茱萸-黄连药对在治疗胃炎疾病时不是单一途径，这可能与中药配伍相互作用的多成分，多靶点治疗疾病的机制有关，符合中医理论中的“整体观念”，即人是一个有机的整体, 不仅包含了生理上、病理上的整体性还包括了诊治上的整体性[12]。诊断疾病的处方更加要求各药味协同发挥作用，以达到最好的治疗效果。

表1 吴茱萸黄连活性成分筛选(OB≥30%，DL≥0.18)

表2 胃炎疾病关键靶点及类型

2.3 药物-活性成分-关键作用靶点网络构建与分析

黄连与胃炎相关的作用靶点的活性成分有8个，分别为 berberine、berberrubine、(R)-canadine、berlambine、palmatine、coptisine、worenine、quercetin；吴茱萸与胃炎相关的作用靶点活性成分有17个，分别为rutaecarpine、isorhamnetin、beta-sitosterol、Rutalinidine、dihydrorutaecarpine、Evodiamine、1-(5,7,8-trimethoxy-2,2-dimethylchromen-6-yl)ethanone、hydroxyevodiamine、6-OH-Luteolin、Evodiamide、Goshuyuamide I、Goshuyuamide II、Gossypetin、Gravacridoneshlirine、N-(2-Methylaminobenzoyl)tryptamine、quercetin、berberine。其对胃炎作用靶点对应的共同活性成分为 berberine、quercetin，将吴茱萸-黄连药对药味名称、活性成分mol ID 号、疾病名称、与胃炎相关的关键靶点名称，输入Cytoscape软件进行网络构建及可视化(见图1)。平行四边形代表胃炎疾病，长方形代表吴茱萸-黄连药对药味黄连和吴茱萸，三角形代表活性成分，椭圆形代表靶点，相关连线代表二者之间的相互作用关系。如图2所示，结果显示，网络中有75个节点和89条边，连线代表二者之间相关，其中PTGS1与多种活性成分相关，推测为胃炎关键靶点。

图1 吴茱萸-黄连药对活性成分及胃炎关键作用靶点网络

2.4 关键靶点基因蛋白质相互作用网络分析

将吴茱萸-黄连药对治疗胃炎的18个潜在的关键靶点基因导入String数据库平台，设置物种为人类，获取蛋白质相互作用关系，得到各蛋白相互作用图(见图2)。网络中包含了18个节点以及86条边，其中前五个连线最大的基因为MYC、CASP3、CCND1、EGFR、CASP8。平均节点度为9.56，推测这些靶点基因为吴茱萸-黄连药对治疗胃炎的关键靶点。

图2 吴茱萸-黄连药对抗胃炎相关基因的蛋白质相互作用网络

2.5 吴茱萸-黄连药对治疗胃炎的关键靶点基因GO分析

GO富集分析显示，吴茱萸-黄连药对中的18个关键靶点基因选取错误率P<0.05的前20个功能信息(见表3)发现，吴茱萸-黄连药对活性成分治疗胃炎所涉及到的功能主要有对不同蛋白的结合,其中有蛋白磷酸酶、谷胱甘肽结合、细胞因子受体、凋亡受体、生长因子受体以及与过氧化氢受体有关的受体，肿瘤坏死因子家族受体等。其次还有与激活转录因子结合功能、跨膜转运蛋白酶的功能、磷脂酶激活功能、 依赖于细胞周期蛋白的丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂功能、NAD+ADP-核糖转移酶功能等。

表3 吴茱萸-黄连药对治疗胃炎基因具有的GO功能信息

续表3

2.6 吴茱萸-黄连药对治疗胃炎的关键靶点KEGG分析

通路富集选取发生错误率P<0.05的前20相关通路(见表4)发现，与吴茱萸-黄连药对治疗胃炎相关的通路主要有HIF-1信号通路、肿瘤坏死因子TNF信号通路。此外，吴茱萸-黄连药对治疗胃炎还和结肠直肠癌、膀胱癌、小细胞肺癌、前列腺癌、肉瘤相关疱疹病毒感染、艾巴氏病毒感染、人类巨细胞病毒感染、癌症微型病毒、乙型肝炎、丙型肝炎、多种细胞凋亡通路、酪氨酸激酶抑制剂耐药通路、癌症的蛋白聚糖通路、军团菌病通路有关。说明吴茱萸-黄连药对在治疗胃炎过程中不止依赖于单一通路，而且还从不同疾病的通路着手，对胃炎进行多方面治疗，这为吴茱萸-黄连药对预防和治疗胃炎提供了新的方案。

表4 吴茱萸-黄连药对治疗胃炎疾病的关键靶点KEGG通路分析

3 讨论

2015版《中国药典》记载吴茱萸味辛、苦，热；有小毒。归肝、脾、胃、肾经。功能与主治有散寒止痛，降逆止呕，助阳止泻。用于厥阴头痛，寒疝腹痛，寒湿脚气，经行腹痛，脘腹胀痛，呕吐吞酸，五更泄泻。吴茱萸主要生物活性成分为生物碱类，包括吴茱萸碱、去氢吴茱萸碱、小檗碱等，其主要药理作用是可以增强心肌收缩力，抗再灌注引起的心肌缺血性心率失常，对胃肠产生抗炎镇痛影响[13-15]。黄连味苦，寒。归心、脾、胃、肝、胆、大肠经。功能与主治有清热燥湿，泻火解毒。用于湿热痞满，呕吐吞酸，泻痢，黄疸，高热神昏，心火亢盛，心烦不寐，心悸不宁，血热吐衄，目赤，牙痛，消渴，痈肿疔疮；外治湿疹，湿疮，耳道流脓。黄连的主要生物活性成分也是生物碱，如小檗碱、黄连碱、掌叶防己碱等。黄连的药理作用主要以抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗病毒为主[16-17]。本文对吴茱萸-黄连药对治疗胃炎成分筛选后发现，从吴茱萸中筛选出吲哚类生物碱8个(rutaecarpine、Evodiamine、Goshuyuamide I、Goshuyuamide II、N-(2-Methylaminobenzoyl)tryptamine 、hydroxyevodiamine、dihydrorutaecarpine、berberine)，酰胺类1个(Evodiamide)，黄酮类成分4个(isorhamnetin、quercetin、6-OH-Luteolin、Gossypetin)，挥发油2个(beta-sitosterol、Rutalinidine)，其他类2个(1-(5,7,8-trimethoxy-2,2-dimethylchromen-6-yl)ethanone、Gravacridoneshlirine)。从黄连中筛选的活性成分除槲皮素属于黄酮类(quercetin)成分，其他7个成分(berberine、berberrubine、(R)-canadine、berlambine、palmatine、coptisine、worenine)均为生物碱。研究证实，吴茱萸与黄连二者配伍后水煎液中吴茱萸生物碱含量溶出减少，而吴茱萸酰胺、次吴茱萸碱等成分则溶出增强，部分挥发油含量也有所增加，且检测出了二者单煎液中未有成分[18]。在二者配伍对胃肠疾病的研究中发现，吴茱萸-黄连药对水煎液及生物碱成分均具有抗胃溃疡作用，可以减少胃黏膜的充血、出血和糜烂, 减少黏膜层和黏膜下层的炎性细胞浸润，但是生物碱组则优于水煎液组，其胃黏膜损伤抑制率达到81.14%。在建立的寒热大鼠胃黏膜损伤模型中，吴茱萸-黄连药对均可以抑制幽门螺旋杆菌、促进胃黏膜修复、炎症因子IL-8，肿瘤坏死因子TNF-α含量也明显降低[19]，因此，推断吴茱萸-黄连药对治疗胃炎的主要有效成分是生物碱，对不同证候的胃炎均有作用[20]。

通过预测吴茱萸-黄连药对与胃炎疾病共有靶点基因是CASP3、EGFR、IL-6、MYC、CCND1等共18个。CASP3参与caspase的激活级联,负责凋亡的执行[21]。EGFR 是表皮生长因子受体，IL-6是细胞介素，研究发现，在辣椒煎液复制的胃热型大鼠模型中，给药左金丸组明显减低IL-2、IL-6、IL-1β含量，显著增加血清中谷胱甘肽-S-转移酶、还原型谷胱甘肽、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等抗氧化相关的酶含量[22]。而本文在对吴茱萸-黄连药对治疗胃炎基于 GO 功能富集化分析中发现，吴茱萸-黄连药对活性成分治疗胃炎所涉及到的功能主要有对不同蛋白的结合,其中有蛋白磷酸酶、谷胱甘肽、细胞因子受体、凋亡受体、血管内皮生长因子受体以及与过氧化氢受体有关的受体，肿瘤坏死因子家族受体等，说明吴茱萸-黄连药对在治疗胃炎疾病时主要功能是抗胃黏膜氧化损伤，抑制炎症因子的产生，修复胃黏膜表皮细胞。

关键靶点基因通路(KEGG)分析发现吴茱萸-黄连药对治疗胃炎还和结肠直肠癌、膀胱癌、小细胞肺癌、前列腺癌、肉瘤相关疱疹病毒感染、艾巴氏病毒感染、人类巨细胞病毒感染、癌症微型病毒、乙型肝炎、丙型肝炎、多种细胞凋亡通路、酪氨酸激酶抑制剂耐药通路、癌症的蛋白聚糖通路、军团菌病通路、HIF-1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等相关。尤其以HIF-1信号通路最为重要，HIF-1信号通路参与生物发育、代谢、贫血、损伤修复等生理和病理生理过程，HIF-1(低氧诱导因子-1)是感知低氧的关键蛋白质，其在神经干细胞增值中有着重要作用[23]，这为胃炎发病过程中胃黏膜损伤的治疗提供了可能性。此外，在基于网络药理学探讨吴茱萸-黄连药对治疗胃癌、高血压、胃溃疡等胃肠疾病时[11，24-26]涉及到很多相类似的信号通路及功能。这使得吴茱萸-黄连药对作用不同疾病时会通过相同的作用机制，其基本功能主要从抗氧化、抗损伤、增强机体自身修复、启动相关凋亡程序及凋亡因子清除机体障碍，这也使得吴茱萸-黄连药对成为治疗癌症的潜在药物。但是这些推测的作用通路还有待于后期实验更进一步验证。

综上所述，本研究应用网络药理学方法，从理论上初步分析了吴茱萸-黄连药对治疗胃炎的主要活性成分为生物碱类，通过HIF-1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等发挥抗氧化、抗损伤、抑制炎症因子产生等作用。结果提示吴茱萸-黄连药对在胃炎治疗过程中运用多通路联合协同方式，为胃炎的防治和治疗提供了可行性理论指导以及对今后的胃炎研究提供了新思路。