沈 霞

(嘉应学院 梅州师范分院，广东 梅州 514087)

食用菌是可食用的大型丝状真菌的总称，含有丰富的蛋白质和氨基酸，受到越来越多人的青睐，食用菌养殖已成为我国农业的重要产业。由于食用菌的生产过程具有密闭、潮湿和不见光等特点，虫害和菌害一直是影响食用菌产量和品质的主要因素之一。我国GB 2763-2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》允许在生产中使用氟虫腈、阿维菌素、吡虫啉、除虫脲、拟除虫菊酯、多菌灵、百菌清等杀虫剂、杀菌剂来防治该类病害，但对最大残留量做了规定，如氟虫腈在蘑菇中的最大残留限量为0.02 mg/kg，且是以氟虫腈及其代谢物氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜之和计[1]。目前中国登记用于食用菌的杀虫剂、杀菌剂品种与国外相比较少[2-3]，食用菌生产中农药滥用的现象较严重[4]。农药的滥用不仅会造成对食用菌和产地环境的污染，还可能会引起食用菌农药残留超标，影响食用者的身体健康。此外，对于部分农药[5-6]，其代谢产物毒性比母体强，且两者的协同效应会使毒性增加[7]。因此，研究建立高效准确的同时测定杀虫剂、杀菌剂及其代谢物残留的检测方法，对于保障食用菌安全具有重要意义。

目前对杀虫类、杀菌类农药残留的研究集中在环境、食品及水果等基质中，食用菌基质也有少量研究报道，但这类研究的检测对象主要以施用的原药为主，往往未涉及危害可能更大的代谢物[8-9]。常用的检测方法包括气相色谱法(GC)[10-11]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[12]、气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)[13]、高效液相色谱法(HPLC)[14]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[15-17]等。其中，很多杀虫剂、杀菌剂的代谢物由于性质稳定，不易被气化，需要衍生后才能用GC、GC-MS或GC-MS/MS分析，衍生化过程繁琐且重现性差；HPLC法操作简单，但检出限高，选择性差，且易出现假阳性；而LC-MS/MS法的适用范围广、选择性强、灵敏度高，特别是质谱的多反应监测技术可大大提高选择离子的灵敏度，在痕量分析方面具有很大优势，适用于食用菌中低含量目标物的检测[9,18]。我国2016年发布的GB 23200.12-2016[19]和GB 23200.15-2016[20]相关标准，虽包含了氟虫腈、双甲脒等部分农药，但未包含其代谢物及百菌清、福美双、除虫脲等化合物。此外标准方法使用固相萃取柱净化，实验过程耗时较长。本实验通过优化分散固相萃取净化方法以及液相色谱-质谱条件，建立了快速、通用的同时测定新鲜食用菌中19种常用杀虫剂、杀菌剂及其代谢物残留的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)分析方法，为食用菌安全评价提供技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

岛津LC-20 超高效液相色谱仪串联AB Triple Quad 5500三重四极杆质谱仪(美国AB Sciex公司)；TurboVap LV氮吹仪(瑞典Biotage公司)；KQ-500D数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；3K15 离心机(德国Sigma公司)；Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司)；MS3涡旋仪(德国IKA公司)。

氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜、咪鲜胺、双甲脒、噻菌灵、多菌灵、福美双、马拉硫磷、噻虫嗪、噻虫胺、吡虫啉、百菌清、除虫脲、乐果、灭蝇胺标准溶液(均为100 mg/L)购自农业部环境保护科研监测所；2,4,6-三氯苯酚(纯度大于99%)购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH；N-(2,4-二甲苯基)-N’-甲基甲脒盐酸盐(纯度大于98%)购自加拿大TRC公司。乙腈、丙酮(色谱纯)购自美国Merck公司；N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基硅烷键合硅胶(C18)、石墨化炭黑(GCB)、0.22 μm聚四氟乙烯滤膜购自CNW公司；氯化钠、无水硫酸镁、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠(分析纯)购自广州化学试剂厂，无水硫酸镁使用前需在马弗炉中550 ℃烘干4 h。

样品：随机购买本地市售平菇、香菇、金针菇、杏鲍菇、草菇、木耳、银耳等新鲜样品共30种，其中平菇4种，香菇5种，金针菇5种，杏鲍菇(鸡腿菇)4种，草菇2种，茶树菇2种，木耳5种，银耳3种。取样前混合均匀。

1.2 标准溶液的配制

混合标准中间液：分别称取或量取适量的待测物标准品或标准溶液，用乙腈-丙酮(体积比1∶1)配成单标储备液(20.0 mg/L)；然后分别吸取适量的单标储备液，用乙腈稀释成混合标准中间液，其中N-(2,4-二甲苯基)-N’-甲基甲脒、灭蝇胺、多菌灵、噻虫嗪、马拉硫磷的质量浓度为0.5 mg/L，乐果、除虫脲的质量浓度为2.0 mg/L，其余待测物的质量浓度为1.0 mg/L。

标准工作液：分别吸取10.0、20.0、50.0、100、200、500 μL的混合标准中间液，用空白基质提取液稀释定容至10 mL，得到系列混合标准工作溶液。

所有标准溶液均保存于4 ℃条件下。

1.3 样品制备与提取

1.3.1 样品制备将食用菌样品切碎混匀，均质成浆，装入洁净的容器内，于-18 ℃冷冻保存。

1.3.2 样品提取称取10 g均质后的试样(精确至0.01 g)于50 mL塑料离心管中，加入20 mL乙腈，然后加入4 g无水硫酸镁、1 g氯化钠、1 g柠檬酸钠、0.5 g柠檬酸氢二钠，盖上离心管盖，涡旋1 min，振摇提取5 min后，4 200 r/min离心5 min。吸取6 mL上清液加至装有500 mg无水硫酸镁、40 mg PSA及40 mg C18的15 mL塑料离心管中，涡旋混匀1 min，4 200 r/min离心5 min，准确吸取2 mL上清液于10 mL试管中，40 ℃水浴中氮气吹至近干。加入1 mL 20%乙腈水溶液复溶，经0.22 μm聚四氟乙烯滤膜过滤后，待测定。

1.4 检测条件

色谱柱：Shim-pack XR-ODS液相色谱柱(2.0 mm×100 mm×2.2 μm)；柱温：30 ℃；进样量：5 μL；流速：0.3 mL/min；流动相：A为乙腈，B为水，梯度洗脱程序：0～3 min，80% B；3～6 min，80%～20% B；6～9 min，20% B；9～9.5 min，20%～80% B；9.5～12 min，80% B。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI+和ESI-同时扫描)；数据采集：多反应监测(MRM)；喷雾电压：5 500 V；离子源温度：400 ℃；雾化气压力：0.345 MPa；辅助气压力：0.414 MPa；气帘气压力：0.138 MPa；去簇电压：80 V；碰撞室出口电压：10 V。19种化合物的保留时间、母离子、定性定量离子和碰撞电压见表1。

表1 19种杀虫剂、杀菌剂及其代谢物的质谱参数Table 1 MS parameters of 19 insecticides，fungicides and their metabolites

2 结果与讨论

2.1 检测条件的优化

2.1.1 质谱条件的优化在多反应监测模式下，对19种待测物的质谱条件进行优化。将目标化合物的单标标准溶液分别在ESI+和ESI-两种模式下进行扫描。结果显示，大部分化合物在ESI+模式下易得到[M+H]+准分子离子峰，质谱信号响应较强;对于2,4,6-三氯苯酚、氟虫腈及其代谢物、除虫脲，由于其含有酚羟基、三氟甲基等基团，在ESI-模式下得到较高响应的[M-H]-准分子离子峰。选择各化合物的特征准分子离子峰为母离子进行二级质谱分析，以响应值最大的碎片离子为定量离子，次级响应最大的碎片离子为定性离子，优化质谱参数。19种待测物的最佳质谱条件如“1.4”所示。

2.1.2 流动相的优化使用UPLC-MS/MS检测时，通常在流动相中加入甲酸、氨水等试剂以提高响应，但由于19种待测物需在ESI+和ESI-两种模式下同时检测，为兼顾各化合物的响应，流动相中未使用甲酸、氨水等试剂。对于有机相，分别考察了甲醇和乙腈对目标化合物的分离效果，结果显示，两种有机相下目标物的质谱响应相当，但有机相为乙腈时，色谱峰形更好、色谱柱柱压低，因此选用乙腈作为有机相。综上，实验选择乙腈与水作流动相，此时目标物的检测灵敏度高，分离度好，可以满足检测分析要求。

2.1.3 色谱柱的选择考察了Shim-pack XR-ODS(2.0 mm×100 mm×2.2 μm)、Agilent Eclipse Plus C18(2.1 mm×100 mm×1.8 μm)、Waters ACQUITY UPLC BEH(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)和Thermo Hypersil GOLD(2.1 mm×100 mm×1.9 μm)4种液相色谱柱对19种待测物的分离效果。结果表明，所有目标化合物在4种色谱柱上均能实现有效保留及分离。实验选择低成本的Shim-pack XR-ODS(2.0 mm×100 mm×2.2 μm)色谱柱进行分离。在最优UPLC-MS/MS检测条件下，19种待测物的多反应监测色谱图如图1所示。

2.2 提取与净化方法的优化

由于香菇、木耳等食用菌样品中含有大量黑色素，提取液颜色较深，若提取后直接测定，会对目标物的检测产生严重干扰，因此需对提取液净化后再上机分析。目前，农药残留检测国家标准中常用的净化方式有固相萃取(SPE)法和分散固相萃取(QuEChERS)法[19,21]。SPE法操作相对复杂耗时，且常使用甲苯等毒性较大的有机试剂。QuEChERS技术是近年发展起来的一种快速、简便的样品前处理技术，方法操作简单、迅速，且处理过程中避免了毒性较大的有机试剂，因此本实验采用QuEChERS提取净化方法。

为提高对提取液pH变化敏感的目标物的萃取效率，实验采用欧盟推荐的QuEChERS提取方法。在提取过程中加入柠檬酸钠和柠檬酸氢二钠，形成缓冲盐体系，不仅能有效提高pH敏感化合物的提取效率，还能防止目标物在提取放热环境中降解。实验比较了PSA、C18和GCB 3种QuEChERS材料的不同用量组合(20、40、60 mg)对木耳阴性加标样品(10 μg/kg)提取回收率的影响，结果见图2。结果表明：混合吸附剂材料中含有GCB时，所有目标物的提取效率均未超过40%，而吸附剂未含有GCB的样品组中，目标化合物的回收率均在50%以上，说明加入GCB后，大量目标化合物会被GCB吸附。而对于PSA和C18不同组合，C18用量变化对回收率的影响不及PSA明显，这是由于C18主要吸附提取液中含量较少的非极性物质，而PSA主要针对含量较多的有机酸、氨基酸、糖类等极性化合物。其中，40 mg PSA/40 mg C18组合时的回收率相对最好，在78%～108%之间，当PSA用量过低时，杂质去除较少，基质效应仍较明显；当PSA用量较高时，部分化合物被PSA吸附，导致回收率偏低。综合比较，实验选取用量均为40 mg的PSA和C18组合净化木耳样品。在优化的组合下，对其它基质的加标样品进行检测，回收率为82%～104%，可以满足方法学要求。

2.3 方法验证

2.3.1 基质效应食用菌样品的主要成分为水、蛋白质、氨基酸等，大部分基质相对简单，但由于木耳和香菇样品中含有大量黑色素，在检测过程中会干扰目标化合物的响应，相同浓度的基质标准溶液响应仅为溶剂标准溶液响应的42%～54%，基质抑制效应明显。为消除样品基质效应，采用阴性样品提取液配制标准工作溶液，使目标物在标准工作溶液和样品溶液中均具有相似的离子化环境，确保了检测方法定性与定量分析的准确性。

图2 木耳加标样品中不同用量PSA、C18和GCB组合的回收率对比Fig.2 Recoveries comparison of different combinations of PSA,C18 and GCB in spiked black fungusthe numbers(1-19) denoted were the same as those in Table 1

2.3.2 线性范围与检出限在最优的质谱和色谱测定条件下，对“1.2”中19种待测物的系列标准工作液进行测定，以各化合物定量离子的峰面积为纵坐标(y)，对应的质量浓度为横坐标(x，μg/L)，进行线性回归计算。代表性基质木耳中目标化合物的线性方程、线性范围和相关系数见表2，结果表明，19种待测物在一定质量浓度范围内线性关系良好，相关系数(r2)均大于0.998 0。

通过测定质量浓度为5.0 μg/L(N-(2,4-二甲苯基)-N’-甲基甲脒、灭蝇胺、多菌灵、噻虫嗪、马拉硫磷)、10.0 μg/L(双甲脒、噻菌灵、福美双、噻虫胺、吡虫啉、百菌清、咪鲜胺、2,4,6-三氯苯酚、氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜)和20.0 μg/L(乐果、除虫脲)的标准工作液，计算得到各化合物的信噪比和仪器检出限，结合前处理过程，最终计算得到各化合物的方法检出限(LOD，S/N=3)和定量下限(LOQ，S/N=10)分别为0.2～0.6 μg/kg和0.5～2.0 μg/kg，其中木耳基质的相关结果见表2。该方法的灵敏度高，适用于食用菌中19种杀虫剂、杀菌剂及其代谢物的定量分析。

表2 木耳基质中19种待测物的线性方程、线性范围、相关系数、检出限及定量下限Table 2 Linear equations,linear ranges,correlation coefficients(r2),LODs and LOQs of 19 analytes in black fungus

2.3.3 回收率与相对标准偏差由于食用菌种类繁多，基质差异较大，不同品种对方法的回收率影响也不同。因此在最优实验条件下，选取3类食用菌(香菇、木耳、银耳)的阴性样品进行加标回收实验，考察了方法的回收率和相对标准偏差(RSD)。每类食用菌分别添加3水平的标准溶液，加标浓度分别为1倍、2倍和10倍LOQ，每个浓度平行测定6次，计算回收率及RSD。结果显示，3类食用菌样品的加标回收率为83.1%～106%，RSD为5.0%～12%(见表3)。方法的准确度和精密度均能满足日常检测定量分析的要求。

表3 19种待测物的加标回收率及相对标准偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations of 19 analytes(n=6)

图3 阳性香菇样品中百菌清的提取定量离子色谱图Fig.3 Extracted ion chromatogram of chlorothalonil in lentinus edodes

2.4 实际样品的测定

为评价方法的有效性，采用本方法测定了30个市售的平菇、香菇、金针菇、杏鲍菇、草菇、木耳、银耳等样品，结果发现1个香菇样品中检出百菌清，检出含量为4.72 mg/kg，其阳性色谱图见图3。

3 结 论

本文参照QuEChERS方法，以乙腈溶剂提取，柠檬酸盐提供缓冲环境，氯化钠盐析、无水硫酸镁除水，PSA和C18组合净化，经超高效液相色谱-串联质谱法分离检测后，可同时测定食用菌中19种杀虫剂、杀菌剂及其代谢物。实验通过对检测条件、样品前处理及净化手段的优化，使得该方法在香菇、木耳、银耳等多种样品基质中均能得到较好的回收率及重现性。本方法操作简单、可行性强、回收率高、结果准确、检出限低，各项方法学技术指标均满足定性、定量分析要求，适用于食用菌中19种杀虫剂、杀菌剂及其代谢物的测定，可为食用菌中其它农药残留的风险监控提供有效的技术支持。