徐君宜，袁 群，高志山，徐 尧

（1.南京理工大学 电子工程与光电技术学院，江苏 南京 210094；2.江苏曙光光电有限公司，江苏 扬州 225109）

引言

血红细胞的形貌特征是医学诊断领域的一项重要指标，其体积过大或者过小、形貌发生异化等可以为包括贫血、白血病等在内的多种血液疾病[1]、高血压[2]和恶性肿瘤[3]等疾病提供诊断依据。因此，通过检测血红细胞的形貌，可以实现对疾病的早期预防和诊断。传统的血红细胞形貌检测方法多数需要对血红细胞进行荧光标记[4]，虽然可以获得较高的灵敏度和准确度，但是会对细胞造成不可逆的伤害，对细胞的生理行为造成干扰[5-6]。

成熟的血红细胞是无核的，可以看作折射率分布均匀的透明体，细胞厚度的变化会改变透射光的相位。因此，依据相位变化可以反演出细胞的大小、厚度等形貌信息。这种测量血红细胞形貌的方法就是免标记相位检测技术。如今，该方法凭借其免标记、无损伤的优点快速发展，在生物医学领域得到了广泛的应用。

定量相位测量主要基于干涉法，并将干涉和显微相结合，实现非接触、高精度的测量。传统的细胞相位测量主要是针对静态的生物细胞样本，测量前提是忽略样本随时间的变化量。美国麻省理工学院激光生物医学研究中心G.Popescu 研究组在2004年提出了傅里叶相位显微技术（FPM）[7]，该技术结合了干涉和显微技术，利用分时相移采集四幅干涉图。但该方法只能测量静态样品，不能实现对包括细胞增殖、运动等细胞的动力学过程进行相位检测。自2012年以来，动态细胞定量相位测量技术得到了快速发展，出现了多种相位检测的新技术[8]。北京理工大学的李帅帅于2015年在分步移相干涉显微技术的基础上，提出了基于同步移相干涉测量细胞高度的方法[9]。该系统类似马赫曾德尔系统，设计了分光相移系统，通过一次拍摄采集四幅干涉图，通过该系统实现了单个神经细胞高度的测量。浙江大学的凌瞳等人在2017年提出了一种基于随机编码混合光栅的宽带灵敏度增强干涉显微技术，利用两个四波前横向剪切干涉仪进行实时定量相位成像[10-11]，用该系统实现了实时提取血红细胞的动态相位。

现有的血红细胞形貌检测手段虽然实现了对活体血红细胞的相位检测，但是只对离体细胞进行测量，未能对在体微血管内的血红细胞进行实时测量。本课题组的前期工作设计了反射式同步移相显微干涉系统，测量了模拟微血管内的血红细胞形貌[12]。但是该系统是基于反射式的光路结构，光路两次经过样品会带来较大的像差，因此复原出的血红细胞形貌不够准确。透射式同步移相显微干涉成像系统是把同步移相技术与激光显微干涉技术相结合，结合了同步移相技术抗振性能好、实时性好，以及透射式干涉显微技术光路简单、像差引入小和空间分辨率高的优点。因此，本文提出将该方法用于微血管内血红细胞的相位测量，并恢复出微血管内血红细胞的形貌，在系统实验构建、相位提取、放大率校正、形貌复原等方面开展了相关研究工作。

1 原理及算法

1.1 测量原理

哺乳动物成熟的血红细胞是双凹圆盘结构，尺寸信息如图1所示，直径为7.0 μm～8.5 μm，最高高度为2.4±0.1 μm，最低高度为1.0±0.8 μm，可以看作是折射率为常数的透射样品。

图1 人血红细胞尺寸图Fig.1 Size of human red blood cells

正常的血红细胞折射率为1.395，血浆的折射率为1.335。当探测光经过均匀介质时，折射率的差值会导致光程差的变化。光程表达式为

式中：l为光程；n为介质折射率；s为光走过的距离；c为光速；v为光在介质中传播的速度。由于正常血红细胞与周围血浆折射率存在差异，当探测光束一部分通过血红细胞，另一部分不通过血红细胞时，就会存在光程的差异。如图2所示，一束探测光束垂直通过血液，取其中的细光束a和b来讨论。

图2 血红细胞与周围血浆光程差变化示意图Fig.2 Change of optical path difference between red blood cells and surrounding plasma

将光束a的光程记作la，光束b的光程记作lb，光束a和光束b光程差的绝对值记作|∆l|=|la−lb|，血浆折射率记作np，血红细胞折射率记作nRBC，光通过血红细胞的几何路程记作dRBC，光通过血管的几何路程记作dp，可以得到：

由（4）式可以计算出光通过血红细胞的几何路程为

由此可知，在血红细胞和血浆折射率已知的情况下，只要求出光程差的值，就可以精确地求得光在血红细胞中通过的几何路程。相位差 ∆φ与光程差 ∆l的关系为

式中：λ是探测光的波长，当使用本文提出的同步移相显微干涉方法检测样品时，结合（4）式和（6）式，可以得到血红细胞在光轴方向的厚度d为

1.2 实验光路

本文设计的实验光路如图3所示。He-Ne 稳频激光器发出一束波长632.8 nm的线偏振光，经过扩束准直系统后，经过与x轴夹角θ的偏振片，然后经过偏振分光棱镜1 分成两束偏振方向正交的参考光（P光）和测试光（S光）。测试光经过样品和显微物镜后，出射光是发散的，经过与显微物镜共焦放置的成像透镜后平行出射。参考光和测试光分别经过反射镜折反后，经偏振分光棱镜2 合束成为沿相同方向传播的两束偏振态正交的平行光束。然后两束偏振态正交的平行光经过快轴与x轴成45°的λ/4 波片，参考光和测试光分别变成左旋和右旋圆偏光，此时两束光由于偏振态正交而无法发生干涉，最后成像在微偏振片阵列相机靶面上。微偏振阵列是由一系列不同偏振方向的微偏振片规律排列组成的，这些偏振片的透光轴分沿与x轴成0°、45°、90°、135°夹角的4个方向。因此，参考光和测试光仅在这4个方向上发生干涉，分别得到0、π/2、π、3π/2的相位延迟量，然后经过CCD 进行图像采集，同时获得四幅移相干涉图。最后，采用四步移相算法进行相位提取，采用质量图引导法进行相位解包处理，得到被测样品的相位信息[13-15]。

图3 透射式同步移相显微干涉光路图Fig.3 Optical path of transmission-type simultaneous phaseshifting microscopic interference

1.3 微血管中血红细胞形貌的提取方法

干涉检测系统自身可看成一个像差完善校正或者像差受限的系统，但模拟微血管作为一种管状结构，将在检测光路中引入较大的像差。血红细胞位于模拟微血管中，其形貌引入的相位变化相当于在模拟微血管引入的较大像差基础上再引入一个微小像差变化。而对于血红细胞的形貌测量来说，其高度和直径等尺寸信息是必要的测量结果，因此如何在波前相位图中提取出微弱的血红细胞相位信息是需要考虑的问题。

本文提出一种于微血管波面相减的血红细胞形貌求解方法，即在同一位置分别采集模拟微血管干涉图和通有血红细胞的微血管干涉图，分别计算获取相位后，直接相减扣除微血管附加的相位影响。步骤如下：

1） 采集未通有血红细胞的模拟微血管干涉图，进行相位提取和相位解包，得到波面W1；

2） 在相同位置采集通有血红细胞的模拟微血管干涉图，进行相位提取和相位解包，得到波面W2；

3） 求波面W2和波面W1之间的残差ERROR=W2−W1；

4） 提取出血红细胞的相位φRBC，并恢复出形貌。

2 实验与分析

2.1 实验装置

干涉光源是Thorlabs公司的HRS015B型He-Ne 稳频激光器，工作波长为632.8 nm；成像透镜是Thorlabs公司的双胶合消色差透镜，工作波长范围为400 nm～700 nm，焦距f1为400 mm；显微物镜选择了金相平场消色差50X 明场显微物镜，其参数NA为0.55，有效工作距为8.2 mm，焦距f2为4 mm，焦深为0.9 μm，物方视场为0.5 mm。可计算得到该显微物镜的理论分辨率为0.61λ/NA=0.7051 μm，与成像物镜组成的系统放大率为β=f1/f2=100。通过对系统的放大倍率进行实验标定，得到系统的实际放大率为101.6倍。微偏振阵列相机选择了4D Technology公司的PolarCam V型号微偏振片阵列相机，该相机的工作波段为350 nm ～1060 nm，靶面上像素单元的尺寸为7.4 μm，像素数为640×450 pixels。

2.2 实验样品

模拟微血管样品由以下几个部分组成：用内径为100 μm、折射率为1.47的玻璃毛细管模拟微血管；用折射率为1.45的光纤折射率匹配液模拟血管周围的组织；用厚度为0.13 mm的显微镜盖玻片和厚度为1.1 mm的高清免洗载玻片夹持血管样品；用折射率为1.395的新西兰兔血红细胞模拟人的血红细胞，其直径为7 μm～8 μm，最高高度为2 μm 左右；用折射率为1.3346的阿氏液模拟血浆。

取长度适中的玻璃毛细管，利用毛细现象将血红细胞吸入毛细管内；然后，在一块干净的载玻片中心处滴一滴光纤折射率液，将毛细管缓慢置于折射率液中间。最后，从一侧将盖玻片缓慢盖下，避免产生气泡。

2.3 微血管中血红细胞形貌的放大率校正

模拟微血管的存在不仅会引入像差，也会对管中样品的放大率带来影响。因此，在ZEMAX 中按照图4所示的物像关系进行仿真，将模拟微血管横截面设为y-z平面，管轴方向设为x方向，光沿z轴传播。由仿真结果可知，物经过系统放大100倍后的像，在x轴方向的放大倍率为105.9，在y轴方向的放大倍率为93.4。

图4 物像关系图Fig.4 Relationship between object and image

由前文放大率标定结果可知，系统的实际放大率为101.6倍，结合仿真结果，对系统的放大率进行校正：x方向的放大倍率为107.6，y方向的放大倍率为94.9。

2.4 微血管内血红细胞相位的提取

在模拟微血管内通入血浆并进行干涉图采集，然后通入带有血红细胞的血浆并进行干涉图采集。图5分别是模拟微血管内的血红细胞的移相干涉图5（a）、通有血红细胞的模拟微血管波面图5（b）、未通有血红细胞的模拟微血管波面图5（c）和计算得到的残差图5（d）。

图5 微血管内血红细胞形貌测量结果图Fig.5 Measurement results of profile for red blood cell in microvessel

对比通有血红细胞的模拟微血管的波面图和残差图可以发现，在直接相位解包得到的模拟微血管内的血红细胞相位图中，血红细胞被淹没在模拟微血管的相位中难以分辨，残差图中可以轻易分辨出血红细胞的相位信息。截取残差图中的血红细胞，并进行高度信息计算。图6是单个血红细胞的三维形貌图6（a）和横截面高度图6（b）。

图6 单个血红细胞形貌测量结果图Fig.6 Measurement results of profile for single red blood cell

2.5 实验结果与分析

对微血管内的血红细胞进行了20组形貌测量实验，得到20组数据，如表1所示。根据表1统计可以得到细胞的平均最高高度和平均直径分别为2.022 μm和7.857 μm；最高高度和直径的标准差分别为0.044 μm和0.210 μm。

表1 微血管内血红细胞直径和最高高度Table1 Diameter and maximum height of red blood cells in microvessel

实验数据计算得到的平均直径和平均最高高度在标准细胞尺寸范围内，并且标准差较小，因此可以认为本系统具有测量并基本准确复原微血管内血红细胞形貌的能力。

3 结论

本文设计并搭建了透射式同步移相显微干涉成像系统，提出了一种基于微血管相位相减的血红细胞相位提取方法。在ZEMAX 中对系统的成像关系进行仿真，校正了系统的放大倍率。通过实验测量了内径100 μm模拟微血管内血红细胞相位的形貌。该实验说明了本文提出的方法具有测量微血管内血红细胞的相位并准确复原形貌的能力，为该系统在此方向的进一步研究提供了实验依据。