常新见，周金柱，范宝超，郭容利，朱琳，赵永祥，牛家强，何孔旺，李彬*

(1.江苏省农业科学院兽医研究所，江苏 南京 210014;2.西藏农牧学院动物科学学院，西藏 林芝 860000)

猪轮状病毒腹泻是由猪轮状病毒(porcine rotavirus)引起的一种以腹泻、厌食、呕吐、脱水为特征的急性传染病。该病多发于寒冷季节，呈地方性流行，各种年龄的猪皆可感染，感染率最高可达90%～100%[1-2]。疫苗接种是目前唯一的防控猪轮状病毒腹泻的方法，因此猪轮状病毒疫苗的研发具有非常重要的意义[3]。轮状病毒(rotavirus)属于呼肠孤病毒科轮状病毒属[4]，基因组由11个不连续的双股RNA片段组成，编码6种结构蛋白(VPs)和6种非结构蛋白(NSPs)，该病毒粒子由3层衣壳组成，最外层衣壳由VP7和纤突蛋白VP4组成[5-6]。轮状病毒的主要抗原蛋白VP4经胰蛋白酶作用后，可裂解为2条长度不等的肽段VP8*和VP5*，其中VP8*片段具有高度的同型特异性[7]。胰蛋白酶可将VP4切割形成VP8*和VP5*，提高轮状病毒的感染性[8]。尽管外衣壳蛋白VP4是重组轮状病毒疫苗开发的重要靶蛋白，可是完整的VP4蛋白的溶解性差，所以在过去几年科研人员将VP8蛋白作为候选蛋白进行了探索[9]。VP8蛋白具有VP4蛋白的主要抗原表位，且决定着VP4蛋白的特异性血清中和反应[10]。陈思静[11]发现VP8*蛋白可诱导病毒中和抗体和小鼠相关保护，细菌表达的VP8*蛋白可诱导高水平的病毒中和抗体，具有可观的疫苗潜力。目前已经上市的轮状病毒疫苗均为减毒活疫苗，有较高的肠套叠风险，所以研究更加安全有效的轮状病毒亚单位疫苗具有重要意义[12]。Dunn等[13]所做小鼠模型的结果表明，VP4、VP8*和VP5*均能刺激小鼠产生中和抗体。本实验室前期对猪轮状病毒开展流行病学调查，发现G9P7型已经成为临床优势基因型[14]。因此，本文对实验室分离到的G9P7型毒株NJ2012的VP8基因进行了克隆，并在原核系统中进行融合蛋白的重组表达，为进一步研究VP8蛋白的结构功能及开发新型轮状病毒疫苗、诊断试剂和治疗药物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

G9P7型猪轮状病毒毒株NJ2012，由江苏省农业科学院兽医研究所人兽共患病防控研究室分离保存。PrimeScript RT reagent Kit、NdeⅠ、BamHⅠ均购自大连宝生物技术有限公司；Trans5α感受态细胞购自TransGen Biotech；DE3感受态细胞购自康为世纪有限公司；pET28a表达载体(卡那霉素抗性)由本实验室保存；HRP标记的羊抗鼠单抗购自Abclonal；抗His-tag鼠单克隆抗体购自Abclonal公司；脱脂奶粉购自伊利；BSA蛋白定量检测试剂盒购自碧云天公司；PVDF膜购自Sigma公司。

1.2 引物设计及PCR扩增

根据NJ2012基因组序列，利用Primer 5.0软件设计引物并将交由南京擎科生物科技有限公司合成。引物序列如下，上游: 5′-GATCCATATGTTATTAGATGGTCCATACC-3′，下游: 5′-CGCGGATCCTATCATCCATGATTGATATACTCAG-3′，并在序列两端分别引入NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点。使用Magen公司的RNA提取试剂盒提取NJ2012病毒全基因组并反转录成cDNA。PCR扩增反应参数如下：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸10 min，共35个循环。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.3 VP8序列同源性分析

选取10株来自不同宿主、常用作疫苗株的轮状病毒的VP8序列作为参考序列(表1)，应用软件DNAStar MegAlign中的Clustalw Method与DNAman中的Mulitiple Alignment进行核苷酸序列与氨基酸序列的同源性比对分析。

表1 参考毒株信息

1.4 目的基因原核表达载体的构建

将PCR产物连接到pMD19-T载体，使用热转化方法将重组质粒转化到Trans5α感受态细胞，随后，提取质粒，对其进行PCR和质粒双酶切鉴定，分别收取PCR产物和质粒双酶切产物使用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，将鉴定为阳性的重组质粒命名为pMD19T-VP8，送至南京思普金生物科技有限公司进行测序鉴定。将测序正确的pMD19T-VP8质粒与表达载体共同使用NdeⅠ和BamHⅠ内切酶进行双酶切处理，进行胶回收。将回收的目的基因与表达载体pET28a(+)进行连接，使用热转化方法将连接产物转化到大肠杆菌Trans5α感受态细胞中，提取重组质粒，对其进行PCR和质粒双酶切鉴定，将PCR产物和质粒双酶切产物使用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，将鉴定为阳性的重组质粒命名为pET28a-VP8。

1.5 重组VP8蛋白的诱导表达与纯化

将鉴定成功的阳性重组菌接种于含卡那霉素的LB培养基，每管3 mL，在37 ℃摇床振荡培养，每隔1 h检测菌液的OD600值，当菌液OD600值为0.6～0.8时加入IPTG终浓度为5 mmol/L，37 ℃摇床振荡培养6 h。随后，分别从2个试管中吸取1 mL菌液，4 ℃，12 000 r/min离心3 min，收取沉淀，同时以诱导的空载体全菌作为对照，SDS-PAGE检测重组VP8蛋白是否成功表达。按照1∶100的比例将成功表达纯化培养的菌液接种于100 mL含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中，在37 ℃的条件下摇床振荡培养，当菌液OD600值为0.6～0.8时，终浓度为5 mmol/L的IPTG诱导重组蛋白表达，37 ℃摇床低温振荡诱导6 h后收集菌液。将诱导后的菌液8 000 r/min离心30 min，弃上清，用PBS(不含尿素)重悬于冰浴中进行超声破碎(功率：40%，60 min)，将超声破碎的菌液4 ℃、8 000 r/min离心30 min，分离上清和沉淀，收取获得沉淀使用2 mol/L尿素吹悬并重悬于冰浴中进行超声破碎(功率：40%，10 min)；分别按照4、6和8 mol/L增加溶液尿素含量至最终完全溶解且呈透亮状态，之后离心，收集上清，将获得的溶液放入透析袋中，依次使用6、4、2、1 和0.5 mol/L尿素溶液和1×PBS溶液在4 ℃条件下对其进行透析，每次4 h。将获得的蛋白溶液使用PEG-8000进行浓缩处理即可获得纯化蛋白，使蛋白浓度为1 mg/mL。

1.6 重组VP8蛋白Western blot检测

将经SDS-PAGE检测的蛋白在115 mA的电流下转膜45 min使其转印到PVDF膜上，使用1×PBST清洗3次，每次10 min；使用5%脱脂乳溶液室温封闭2 h，封闭后使用1×PBST清洗3次，每次10 min；抗His-tag鼠单克隆抗体(1∶4 000)作为一抗，室温孵育1 h，孵育后使用1×PBST清洗3次，每次10 min；羊抗鼠HRP-IgG(1∶4 000)作为二抗，孵育1 h，孵育后使用1×PBST清洗3次，每次10 min；在PVDF膜上加入ECL显色液，使用化学发光成像仪拍照。

2 结果与分析

2.1 VP8序列同源性分析

测序结果表明，从NJ2012毒株克隆的VP8基因片段长为480 bp，编码氨基酸160 aa，该序列与参考毒株序列的核苷酸同源性为53.9%～99.2%，氨基酸同源性为42.1%～97.5%，如表2所示。

表2 NJ2012与参考毒株的VP8序列同源性分析 %

2.2 VP8基因PCR扩增

PCR扩增后，产物电泳结果显示(图1)，扩增出约480 bp的片段，与VP8基因预期大小一致。

M.DL2000 DNA Marker；1～5.VP8基因

2.3 重组表达质粒双酶切鉴定

对重组质粒进行双酶切鉴定，如图2所示。基因片段大小与预期相符，阳性质粒测序结果与NJ2012-VP8基因测序结果进行比对，两者序列完全一致，表明重组表达质粒构建成功。

M.DL5000 DNA Marker;1.重组pET28a-VP8质粒双酶切产物

2.4 重组蛋白SDS-PAGE检测

重组表达菌DE3(pET28a-VP8)由IPTG诱导表达经SDS-PAGE检测，如图3所示，裂解菌体和包涵体在17～25 kDa处出现了1条清晰的条带，约为20 kDa，与目的蛋白大小相符。

M.蛋白Marker；1.pET28a诱导后；2.pET28a-VP8诱导后全菌；3.pET28a-VP8诱导后上清；4.pET28a-VP8诱导后包涵体

2.5 重组VP8蛋白Western blot检测

Western blot检测表明重组VP8蛋白能够与抗His-Tag鼠单克隆抗体发生结合反应，如图4所示，进一步证实了VP8蛋白在DE3宿主菌得到表达。

M.蛋白Marker；1.诱导pET28a；2.未诱导pET28a-VP8；3.诱导pET28a-VP8

2.6 重组VP8蛋白纯化后鉴定

包涵体中有大量重组VP8蛋白存在，经尿素溶解，SDS-PAGE检测可知重组蛋白存在于8 mol/L尿素中(如图5A)；经Western blot鉴定，在17～25 kDa处出现1条清晰条带(如图5B)，与目的蛋白大小一致。

A.重组VP8蛋白纯化后SDS-PAGE检测结果：M.蛋白Marker；1.未纯化VP8蛋白；2.纯化后VP8蛋白

3 讨论

研究表明，猪轮状病毒NJ2012毒株的VP8基因片段大小为480 bp，编码160 aa，与参考毒株的核苷酸序列同源性为53.9%～99.2%，氨基酸序列同源性为42.1%～97.5%。为了提高VP8重组蛋白的表达量，本研究在试验过程中对表达条件进行了优化，结果表明，在37 ℃、IPTG终浓度为5 mmol/L、诱导时间为6 h的条件下VP8蛋白得到最大程度表达。该包涵体在含8 mol/L尿素溶液中可完全溶解，利用尿素梯度透析使其复性，获得的重组蛋白经 SDS-PAGE 鉴定纯度大，蛋白浓度测定为1 mg/mL。毕艳铎等[15]利用原核表达系统所表达的猪轮状病毒VP8*(64～223 aa)具有良好的免疫原性，且产量高可溶，具有极大的商品化潜力。魏晓曼等[16]通过对Gottfried和SB-1A株猪轮状病毒截短VP8*蛋白的免疫原性分析，免疫小鼠后发现蛋白具有较好的免疫原性。本研究获得VP8蛋白存在于包涵体中，蛋白不可溶，考虑到后期蛋白免疫原性及操作简便性，应重新考虑更换表达载体及优化密码子。

本研究室前期经流行病调查发现G9P7型已成为优势基因型，同时本室分离获得的毒株为G9P7型，同类型的毒株相似报道较少。闻晓波等[17]在大肠杆菌中表达轮状病毒株Wa的P8、DS-1的P4和1076的P6，其产量高且高度可溶性，于豚鼠肌内免疫VP8*蛋白(即P8、P4或P6)可产生高水平的中和抗体。2012年，Wen等[18]进一步研究发现，在仅融合6个组氨酸的情况下，VP8核心区也能以可溶形式高效表达，该蛋白在豚鼠模型中可产生高滴度的中和抗体。将VP8蛋白与GST融合表达则可以获得可溶性的VP8蛋白，免疫鸡后可产生高滴度的卵黄抗体[19]。完整的VP8蛋白在大肠杆菌中也以包涵体的形式表达，但其刺激小鼠产生中和抗体的能力与真核表达的VP8蛋白无显著差异，免疫牛和家兔也能产生高滴度的中和抗体[20]。这提示轮状病毒的VP8蛋白是一个重要潜在亚单位疫苗的候选蛋白，需要进一步进行免疫原性的研究。鉴于不同型毒株之间的抗原免疫交叉保护较差，VP8蛋白能否针对临床的毒株产生保护性，需要更为深入的探索。