方振朋 孟宪红 李旭鹏 栾 生 曹家旺 陈宝龙 孔 杰 闫茂仓 胡利华

基于微卫星分子标记的凡纳滨对虾商业苗种遗传多样性分析*

方振朋1,2孟宪红2①李旭鹏2栾 生2曹家旺2陈宝龙2孔 杰2闫茂仓3胡利华3

(1. 上海海洋大学水产与生命学院 上海 201306；2. 中国水产科学研究院黄海水产研究所 农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室 青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室 青岛 266071； 3. 浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室 温州 325005)

为研究我国凡纳滨对虾()商业苗种的遗传多样性特征，于河北、山东、广东、海南等地采集了6个有代表性的凡纳滨对虾品牌苗种，分别命名为黄骅R、东营M、广州P、广州Z、海南S和海南Z，以8个微卫星标记检测其遗传多样性。结果显示，6个品牌的凡纳滨对虾在8个位点呈现不同程度的多态性，其平均等位基因数(a)、期望杂合度(e)、观测杂合度(o)和多态信息含量(PIC)分别为4.5~9.5、0.516~0.733、0.346~0.550和0.472~0.700，各品牌遗传多样性丰富程度从高到低分别为黄骅R>广州Z>广州P>海南Z>东营M>海南S。哈迪–温伯格平衡(HWE)检验显示，4.17% (2/48)的检测结果表现为显著的偏离(0.01<<0.05)，58.33% (28/48)表现为极显著偏离(<0.01)。分子变异方差分析(AMOVA)发现，12%的变异来自品牌间，24%的变异来自品牌内个体间，其余64%的变异均来自所有品牌个体。UPGMA聚类分析结果显示，6个品牌的凡纳滨对虾聚为2个明显的分支，广州P和广州Z聚为一支，东营M、黄骅R、海南Z和海南S聚为一支。主成分分析(PCA)结果显示，各品牌凡纳滨对虾无法单独进行聚类。本研究初步分析了当前国内养殖凡纳滨对虾的遗传背景，实验结果可为凡纳滨对虾良种选育提供数据支撑。

凡纳滨对虾；商业苗种；微卫星；遗传多样性

凡纳滨对虾()原产地主要为中、南美的秘鲁北部至墨西哥太平洋沿岸，尤其以厄瓜多尔沿岸分布最为密集(王兴强等, 2004)。凡纳滨对虾为世界三大养殖对虾之一(张伟权, 1990)，其产量约占全球对虾产量的70%(张龙等, 2019)，具有成活率高、食性广、生长快、适应能力强等优点。凡纳滨对虾于1988年从美国引入，之后迅速在全国范围内普及(于洋, 2014; 唐扬等, 2018)，成为我国海水养殖动物中养殖发展最快的一个种类(马春艳等, 2011)。目前，我国已成为世界上凡纳滨对虾养殖产量最高的国家(颉晓勇等, 2008; 童馨等, 2009)。

随着我国凡纳滨对虾市场需求量的增大，对虾苗种培育方式也出现了转变。目前，在集约化苗种培育技术已达峰值的背景下，有些育苗场为了进一步降低成本，种虾不经选育，长期近交繁殖，随着养殖产量的增大，随之而来的问题也越来越多。最大的问题莫过于养殖对虾遗传多样性下降，加之外来亲本得不到更新，国内养殖对虾出现了种质退化、病害暴发频繁的现象。从长远角度来看，查清我国凡纳滨对虾遗传背景，对进一步培育优良品种和促进可持续健康养殖具有重要指导意义。

分子标记目前已广泛运用于水产动物育种中(张琼等, 2011; 孙苗苗等, 2017; 王军等, 2018)，其中，又以微卫星(Microsatellite或Simple Sequence Repeats)分子标记应用最为普遍。微卫星标记是2~6个碱基为核心的短串联重复序列，重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性且数量丰富，分布于生物体整个基因组中(Tautz, 1989; Schlötterer, 1992)。微卫星标记具有多态性高、重复性好、操作简单、共显性遗传等优点，被广泛用于对虾群体遗传多样性分析(Bringmann, 1996; Postlethwait, 1998; 张天时等, 2005; 曾地刚等, 2008)。本研究利用8个扩增稳定的微卫星位点，对国内6个商业品牌凡纳滨对虾苗种进行遗传多样性分析，初步分析当前国内养殖凡纳滨对虾的遗传背景，为凡纳滨对虾优良品种的选育提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选用我国有代表性的6个品牌凡纳滨对虾商业苗种[平均体长为(49.73±1.53) mm，平均体重为(1.41± 0.11) g]，分别命名为黄骅R、海南Z、海南S、广州Z、广州P和东营M。每个品牌取30尾个体进行肌肉组织DNA提取，共计180尾凡纳滨对虾个体。

1.2 实验方法

采用天根海洋动物组织DNA提取试剂盒进行肌肉组织DNA提取，利用紫外分光光度计(BioImaging ystems, UVP)进行DNA浓度测量，并根据测量结果将DNA稀释至50 ng/μl。将稀释得到的DNA利用 8个微卫星位点进行PCR扩增。PCR反应体系：总体积为20 μl，其中，模板DNA 1.5 μl，(Vazyme) 2 ×Master Mix (Dye Plus) 10 μl，正向和反向引物 (10 mmol/L)各0.8 μl，灭菌超纯水6.9 μl。PCR反应程序：95℃预变性3 min；95℃变性30 s；72℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环；72℃延伸5 min；4℃保存。PCR产物微卫星分型于生工生物工程(上海)股份有限公司，利用ABI 3730XL测序仪完成，所用微卫星位点及其引物信息见表1。

1.3 数据处理

对6个品牌凡纳滨对虾商业苗种进行哈迪–温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)检测和遗传多样性分析。利用GENEPOP version 3.4软件进行HWE检验，得到精确值(H-W)。通过Cervus 3.0计算各位点的等位基因数目(Number of alleles,a)，观测杂合度(Observed heterozygosities,o)、期望杂合度(Expected heterozygosities,e)、8个微卫星位点的多态信息含量(Polymorphism information content, PIC)和无效等位基因频率[Null alleles frequency,(Null)]。利用GenAlEx 6.51软件计算6个品牌凡纳滨对虾在各位点的香农多样性指数(Shannon's diversity index)、8个位点每个品牌特有等位基因(Private alleles)平均值、各品牌间的遗传分化程度和基因流(包括总的ST值以及两两品牌间的ST值)；分子变异方差分析(Analysis of molecular variance, AMOVA)，估测遗传变异在品牌内和品牌间的分配情况；6个品牌间Nei’s无偏遗传距离、遗传相似性系数、品牌间遗传距离矩阵、个体间遗传距离矩阵；利用品牌间和个体间遗传距离矩阵进行主成分分析(Principal coordinate analysis, PCA)。利用NTSYSpc 2.1软件按照遗传一致度进行6个品牌凡纳滨对虾UPGMA聚类。

2 结果

2.1 6个商业品牌凡纳滨对虾苗种遗传多样性分析

6个品牌凡纳滨对虾商业苗种的遗传多样性参数见表2和图1。在8个微卫星位点中，6个品牌凡纳滨对虾总等位基因数为36~76个，最大为黄骅R，最小为东营M。各品牌平均等位基因数为4.5~9.5个。黄骅R平均每个微卫星位点存在1.625个特有等位基因，在所有品牌中最多。东营M平均每个位点存在0.125个特有等位基因，为各品牌中最少。8个微卫星位点的多态信息含量(PIC)值为0.343~0.925，最高为TuMXLv7.56位点，最低为M1103位点，除M1103位点外，其他7个微卫星位点PIC都大于0.5。黄骅R、广州Z和海南Z的香农多样性指数较高，其他3个品牌较低。8个微卫星位点的无效等位基因频率范围为0.031~0.403，5个位点存在无效等位基因。8个微卫星位点分别对6个品牌凡纳滨对虾进行了48次HWE检验。其中，4.17%(2/48)的检测结果表现为显著的偏离(0.01<<0.05)，58.33%(28/48)表现为极显著偏离(<0.01)，其余的37.5%(18/48)符合HWE (>0.05)。

表1 8个微卫星位点信息

Tab.1 The information of 8 microsatellites loci

2.2 6个商业品牌凡纳滨对虾的遗传分化

分子变异方差分析(AMOVA)发现，仅有12%的遗传变异来自品牌间，24%来自品牌内个体间，其余64%的变异均来自所有品牌个体，这表明遗传变异主要存在于个体间(表3)。

6个品牌凡纳滨对虾商业苗种的统计量分别为0.359 (IT)，0.273 (IS)，0.118 (ST)。两两品牌间的值ST在0.034和0.111之间，均<0.15(表4)，且明显的分成两部分。其中，小于0.05的为4组，占全部15组的26.67%，没有出现遗传分化(ST<0.05)；介于0.05和0.15之间的为11组，占全部15组的73.33%，为中等程度分化(0.051，范围为1.806~7.027 (表4)。

2.3 6个商业品牌凡纳滨对虾的遗传聚类

从表5可以看出，东营M和海南Z品牌间的遗传距离最近(0.128)，遗传相似性系数最大(0.880)，亲缘关系最近；广州P和海南S品牌间的遗传距离最远(0.549)，遗传相似性系数最小(0.578)，亲缘关系最远。由图2可以看出，6个品牌的凡纳滨对虾聚为2个明显的分支，广州P和广州Z聚为一支，东营M、黄骅R、海南Z和海南S聚为一支。

2.4 6个商业品牌凡纳滨对虾遗传关系主成分分析

主成分分析(PCA)结果显示(图3)，6个品牌凡纳滨对虾商业苗种产生了明显的遗传歧化。其中，广州P和广州Z最为聚集，其次为东营M和海南Z，之后为黄骅R和海南S，主成分1 (Coord.1)和主成分2 (Coord.2)共解释了总遗传变异的71.22%。在个体水平上，主成分1 (Coord.1)和主成分2 (Coord.2)共解释了总遗传变异的20.05%。从图3可知，6个品牌的180尾凡纳滨对虾个体聚集较为集中，其中，广州P、广州Z和黄骅R 3个品牌的凡纳滨对虾交集最大。同时，每个品牌的凡纳滨对虾个体无法单独聚为一类。

表2 6个品牌凡纳滨对虾在8个微卫星位点中的遗传多样性参数

Tab.2 Genetic diversity indices of 8 microsatellite loci of L. vannamei from 6 brands

3 讨论

微卫星分子标记在种内有高度的遗传变异，是群体遗传分化分析的有效标记(孙效文等, 2008)。微卫星分子标记广泛分布于基因组中，数量众多，容易检测，在分子辅助育种和物种多样性检测等方面被广泛应用(张丽娟等, 2014)。群体的遗传多样性来源于物种适应复杂环境和生存进化(Li, 2016)，其主要表现在等位基因数的丰富和均匀程度、遗传杂合度的大小、多态信息含量的高低3个方面(Beardmore, 1997; 王鹤等, 2016)。研究发现，等位基因越丰富，遗传杂合度数值越大，多态信息含量越高，则群体遗传变异更高，更能应对环境变化，也更能产生优质的种质资源(Eschenroeder, 2016)。

图1 6个品牌凡纳滨对虾商业苗种遗传多样性参数均值(8个微卫星位点)

表3 6个品牌凡纳滨对虾分子变异方差分析

Tab.3 Analysis of molecular variances (AMOVA) of microsatellites in 6 brands of L. vannamei

表4 6个品牌凡纳滨对虾FST值(下三角)与Nm值(上三角)

表5 6个品牌凡纳滨对虾遗传相似性系数(下三角)与遗传距离(上三角)

Tab.5 Genetic similarity coefficient (below the diagonal) and genetic distance (above the diagonal) of six brands’ L. vannamei

图2 根据遗传一致度构建的UPGMA树

关于凡纳滨对虾微卫星标记开发和筛选的工作已有大量报道(Meehan,, 2003; 马宁等, 2013; 杨铭等, 2017)。本研究从实验室发表过的文章(李东宇等, 2016)中筛选出8个扩增稳定的微卫星位点，分析了6个国内品牌的凡纳滨对虾商业苗种的遗传多样性、遗传结构和亲缘关系。结果显示，87.5% (7/8)的位点平均多态信息含量(PIC)都在0.5以上。根据Botstein等(1980)提出的衡量标准，当PIC>0.5时，意味着该位点为高度多态位点，这也说明本研究所引用的微卫星标记的多态性较高。基因杂合度是衡量群体遗传变异水平的理想参数(王日芳等, 2017)，8个微卫星位点中的观测杂合度(o)平均为0.486，期望杂合度(e)平均为0.745，观测杂合度小于期望杂合度，也从一个侧面说明了国内商业苗种凡纳滨对虾出现了杂合子缺失、纯合子过剩的情况。在进行微卫星分型的8个位点中，有5个(62.5%)位点显著偏离HWE (<0.05)。产生该结果的原因：一方面为实验对虾纯合子过剩、杂合子缺失；另一方面为水产动物生物结构较为简单，从而导致的遗传变异度也较高。因此，造成微卫星位点在同一物种不同个体中发生碱基形态和数目的变异，无法扩增正确的等位基因，扩增的无效等位基因会导致分型结果显著偏离HWE (舒妙安等, 2011; 宋忠魁等, 2013)。亲缘关系的远近可以用遗传距离来反映(陈子桂等, 2016; 刘洪涛等, 2018)。在本研究中，遗传距离最大的2个品牌是广州P和海南S，遗传距离最小的2个品牌是东营M和海南Z，并且针对个体的遗传关系主成分分析(PCA)表明，6个品牌的凡纳滨对虾无法依照每个品牌单独聚集，品牌间亲缘关系较为接近。这种结果表明，当前国内不同品牌的凡纳滨对虾来源存在一定的相似性，也可能是二代、三代苗种导致部分品牌对虾出现近交情况，使其亲缘关系逐渐接近。

图3 6个品牌凡纳滨对虾主成分分析

种苗处于对虾产业链上游，其质量对养殖成败起关键作用(黄小帅等, 2019)。本研究所分析的6个品牌凡纳滨对虾商业苗种中，黄骅R与广州Z具有较高的遗传多样性，不同品牌的商业苗种间的遗传特征存在一定差异。在当前凡纳滨对虾养殖规模不断扩大的情况下，研究遗传因素与养殖生产性能之间的关联尤为重要，只有充分掌握对虾群体的遗传背景，才能合理利用杂交优势进行良种选育。

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Genetic Diversity Analysis of Domestic Commercial Brands Seedlings ofBased on Microsatellite Molecular Markers

FANG Zhenpeng1,2, MENG Xianhong2①, LI Xupeng2, LUAN Sheng2, CAO Jiawang2, CHEN Baolong2, KONG Jie2, YAN Maocang3, HU Lihua3

(1.College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Laboratory of Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory of Marine Science and Technology (Qingdao),Qingdao 266071; 3. Zhejiang Key Laboratory of Exploitation and Preservation of Coastal Bio-Resource, Wenzhou 325005)

To clarify the genetic diversity characteristics of domestic commercial brand seedlings of, six domestic commercial brands ofnamely, Huanghua R, Dongying M, Guangzhou P, Guangzhou Z, Hainan S, and Hainan Z, were collected from Hebei, Shandong, Guangdong, and Hainan Province. Their genetic diversity was detected using eight microsatellite markers. The results showed that the average allele number (a), expected heterozygosity (e), observed heterozygosity (o), and polymorphic information content (PIC) were 4.5~9.5, 0.516~0.733, 0.346~0.550, and 0.472~0.700, respectively. The genetic diversity of the six brands ranged from high to low: Huanghua R > Guangzhou Z > Guangzhou P > Hainan Z >Dongying M > Hainan S, and 48 Hardy-Weinberg equilibrium tests were conducted on the 6 brands ofusing 8 microsatellite loci. It was observed that, 4.17% (2/48) showed significant deviation (0.01<<0.05) and 58.33% (28/48) showed extremely significant deviation (<0.01). Molecular variance analysis (AMOVA) showed that 12% of the variance was from the brand, 24% was from the individual within the brand, and the remaining 64% was from all individual brands. UPGMA clustering map showed that each brand ofcould not cluster independently. The analysis showed that the six brands ofclustered into two distinct branches, Guangzhou P and Guangzhou Z clustered into one branch, and Dongying M, Huanghua R, Hainan Z, and Hainan S clustered into another branch. PCA results showed that each brand ofcould not cluster independently. This study preliminarily analyzed the genetic background ofcultured in China. The experimental results can provide data to support the breeding of improved varieties of.

Pacific white shrimp; Commercial seedling; Microsatellite; Genetic diversity

MENG Xianhong, E-mail: mengxianhong@ysfri.ac.cn

S917.4

A

2095-9869(2020)05-0012-09

10.19663/j.issn2095-9869.20190527004

http://www.yykxjz.cn/

方振朋, 孟宪红,李旭鹏, 栾生, 曹家旺, 陈宝龙, 孔杰, 闫茂仓, 胡利华. 基于微卫星分子标记的凡纳滨对虾商业苗种遗传多样性分析. 渔业科学进展, 2020, 41(5): 101–109

Fang ZP, Meng XH, Li XP, Luan S, Cao JW, Chen BL, Kong J, Yan MC, Hu LH. Genetic diversity analysis of domestic commercial brands seedlings ofbased on microsatellite molecular markers. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(5): 101–109

* 浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室开放基金项目(J2018003)、中国水产科学研究院基本科研业务费(2018GH10)、山东省农业良种工程(2017LZN011)、泰山学者良种工程项目和现代农业产业技术体系专项资金(CARS-48)共同资助[This work was supported by Open Research Fund from Zhejiang Key Laboratory of Exploitation and Preservation of Coastal Bio-Resource (J2018003), Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS (2018GH10), Shandong Province Agricultural Seed Improvement Project (2017LZN011), Taishan Scholar Program for Seed Industry, and China Agriculture Research System(CARS-48)]. 方振朋，E-mail: fangzhenpeng@126.com

孟宪红，研究员，E-mail: mengxianhong@ysfri.ac.cn

2019-05-27,

2019-06-15

(编辑 马璀艳)