苏智宏 黎圣金 田长恩 周玉萍

植物钙调素和类钙调素是细胞内最重要的一类Ca2+感受器，CaM/CML 通过与钙调素结合蛋白结合来调节细胞生理过程[1]。拟南芥有4 个CaM 蛋白和50 个CML 基因，干旱胁迫下类钙调素CML37 突变体积累的ABA含量显著低于野生型，表明CML37 正向调节植物对生物和非生物胁迫的响应，参与JA和ABA信号调节[2]。拟南芥IQM4 是一个Ca2+不依赖型钙调素结合蛋白，通过参与ABA合成调节种子休眠和萌发，但IQM4 上游CaM 或CML尚未鉴定[3]。在通过酵母双杂交实验来研究CML37 与IQM4 的相互作用时，观察到转化了pGBKT7- CML37 和pGADT7 质粒的酵母菌在四缺培养基(SD- Ade/His/Leu /Trp)上正常生长并激活了报告基因LacZ 的表达。同时，酵母单杂交实验也证实了拟南芥类钙调素CML37 具有转录激活活性。

1 材料与方法

1.1 材料

拟南芥为Columbia 生态型；大肠杆菌为E.coli DH5α；酵母双杂交系统为Clontech公司的Matchmaker Gal4 Two- Hybrid System3；Carrier DNA 购自Sigma 公司；实验所使用的胶回收试剂盒、DNA 片段纯化试剂盒、限制性核酸内切酶、DNA 连接酶、PRIMER STAR 高保真DNA 聚合酶、rTaq DNA 聚合酶均为TaKaRa 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 拟南芥CML37 与IQM4 基因克隆

从TAIR 数据库获取CML37 和IQM4 的CDS 序列，分别设计克隆引物。以拟南芥cDNA 为模板，利用PRIMERSTAR 高保真DNA 聚合酶进行PCR 扩增，PCR 反应结束后，取少量产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.2 酵母表达载体构建

PCR 产物分别用DNA 片段纯化试剂盒纯化后，其中AD- CML37 片段用EcoR I 和BamH I 定向插入酵母表达载体pGADT7 质粒，BD- CML37 片段用EcoR I 和Pst I 定向插入pGBKT7 质粒，而IQM4 片段用Nde I 和Xma I 分别定向插入pGADT7 和pGBKT7 质粒。4 种连接产物分别转化E.coli DH5α 感受态细胞，涂布至含相应抗生素的LB 固体培养基（pGADT7 为氨苄青霉素抗性；pGBKT7为硫酸卡那霉素抗性），使用克隆用引物直接菌落PCR 鉴定阳性转化子并送至华大公司测序证实。

1.2.3 酵母单杂交分析

采用PEG/LiAC 法将BD- CML37 和BD 质粒分别转化酵母感受态细胞AH109（图1），涂布于SD- Trp；将AD- CML37和AD 质粒分别转化酵母感受态细胞并涂布于SD- Leu，30℃培养4 d 至菌落形成。从SD- Trp 平板上挑取长势良好的单菌落接种于SD- Ade/His/Trp，从SD- Leu 平板挑取长势良好的单菌落接种于SD- Ade/His/Leu，30℃继续培养4 d。

2 结果

2.1 拟南芥CML37 与IQM4 基因克隆及载体构建

拟南芥CML37 的CDS 序列长558bp，IQM4 的CDS 序列长1599bp，克隆产物经PCR 扩增和琼脂糖凝胶电泳后，得到的条带符合预期。连接产物转化E.coliDH5α 感受态细胞，采用菌落直接PCR 鉴定阳性转化子，阳性克隆送至华大公司测序，测序结果证明CML37、IQM4 基因序列内部没有发生改变。

2.2 酵母双杂交分析

前期酵母双杂交实验结果表明，含有AD- IQM4+BD- CM L37 和AD+BD- CML37 质粒组合的酵母菌不仅在四缺培养基上正常生长，还能分解X- α- gal 产生蓝色菌落；但AD- CML 37+BD- IQM4 质粒组合的酵母不能在四缺培养基上生长。结果表明：在酵母细胞内，CML37 不能与IQM4 蛋白相互作用，BD- CML37 融合蛋白具有转录因子功能，而AD- CML37 不具备转录因子功能。

2.3 酵母单杂交分析

酵母单杂交实验中将AD- CML37 质粒转化酵母细胞后，涂布于SD- Leu 上培养4d 后，将转化酵母转接到SD- Leu/His/Ade 上继续培养4d 后没有观察到酵母菌落（图1A）；将BD- CML37 质粒转化酵母细胞后，涂布于SD- Trp 上培养4d 后，挑取筛选培养基上的酵母接种另一种三缺培养基SD- Trp/His/Ade 上继续培养4d 后观察到酵母菌落（图1B）。转化有BD- CML37 质粒的酵母菌能够在三缺培养基上生长，但转化AD- CML37 质粒的酵母菌不能生长。酵母单杂交分析表明，拟南芥CML37 蛋白缺少DNA 结合活性，但具有激活活性；在酵母细胞中，CML37 与BD（DNA 结合域）融合后具有转录因子的功能。

图1 CML37 的酵母单杂交分析

3 结论和讨论

酵母双杂交技术交广泛应用于蛋白分子之间相互作用的研，酵母单杂交实验能够应用于验证转录因子的DNA 结合活性和自激活活性[4]，拟南芥CML37 蛋白有3 个EF- hand 基序，没有其他功能结构域，但酵母双杂交和单杂交分析都证明CML37具有转录激活功能，说明CML37 基因功能研究还存在未认识的问题。