李 敬,尤 颖,,+,赵庆生,周佳欣

(1.河北经贸大学生物科学与工程学院,河北石家庄 050061;2.中国科学院过程工程研究所,北京 100190)

连翘[Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl]为木犀科连翘属植物,作为中国的传统中草药,具有清热解毒、消肿散结、疏散风热等多种功效,并且对生存土壤环境没有特殊要求,在我国山西、河南、河北等地广泛种植[1]。连翘叶为连翘的叶片,《中华本草》记载“连翘茎叶,性寒,主治心肺积热”[2]。研究发现,连翘叶中含有连翘苷、连翘酯苷A、连翘脂素等多种化学成分,其中连翘苷、连翘酯苷的含量远高于常作为药材原料入药的连翘果中的含量[3],这些化合物具有较强的抗氧化、抗病毒等生物活性[4]。

研究表明,连翘叶属于无毒性物质[5-7],这为连翘叶在食品领域开发创造了条件。2017年,山西省颁布了《食品安全地方标准 连翘叶》DBS14/001-2017,在全国首先将连翘叶列入食品范畴,进行管理,规定了连翘叶每日推荐食用量:鲜连翘叶≤15 g/d,干制连翘叶≤6 g/d[8]。在连翘叶开发利用方面,仅有少部分连翘叶制成连翘叶茶食用,大部分连翘叶被丢弃,未得到有效利用,造成资源浪费。本文对连翘叶的功能性成分及其生物活性的研究进行了总结,为连翘叶资源的充分开发利用提供参考。

1 连翘叶成分

连翘叶中成分复杂,除了基本营养成分,还含有连翘苷等多种具备药用功效的化学成分。

1.1 营养成分

连翘叶经干燥后可制得连翘叶茶,王晓燕等[9]分析了有机连翘叶茶的营养成分。表1将连翘叶茶中营养素含量与其他植物茶进行了比较,可以看出,连翘叶茶中蛋白质的含量略低于沙棘茶,与绿茶及沙棘茶相比,连翘叶茶中的脂肪含量最低,仅为0.31%,表明连翘叶属于低脂的食品原料。

表1 有机连翘叶茶与其他植物茶中核心营养素含量对比(%)Table 1 Comparison of organic Forsythia suspensa leaves tea with other plant tea in terms of core nutrient contents(%)

1.2 化学成分

连翘叶含有多种化学成分,包括连翘脂苷类、木脂素类、多酚类、有机酸类等。

1.2.1 化学成分的分子结构及含量 目前报道的连翘叶化学成分结构及含量如表2所示。

表2 连翘叶中主要化学成分Table 2 Main chemical constituents of Forsythia suspensa leaves

续表

续表

《中国药典》2015版规定,药用的连翘果中连翘苷(C27H34O11)含量不得少于0.15%,连翘脂苷A(C29H36O15)含量不得少于0.25%[20]。从表2中可以看出,尽管处理后的连翘叶的化学成分由于产地等条件不同,含量略有差异,但是其中连翘苷和连翘脂苷A的最低含量分别为2.30%和3.31%,远高于药典对于连翘果的含量规定。

1.2.2 主要化学成分的提取方法 连翘叶中含有多种化学成分,但是每种成分的化学、物理特性不一致,因此,针对不同的化学成分需要采用不同的提取方法。

1.2.2.1 连翘苷的提取方法 不同学者采用不同提取方法对连翘叶中的连翘苷进行了提取(表3)。赵咏梅等[21]研究不同提取液中连翘苷的稳定性,结果表明,当pH=7时,连翘苷提取液最稳定。为了提高连翘苷的纯度,在提取后常用大孔树脂柱层析及重结晶等技术进行纯化,得到的连翘苷纯度>95%[22]。

表3 从连翘叶中提取连翘苷的方法及其得率比较Table 3 Comparison of extraction methods and yield of phillyrin from Forsythia suspensa leaves

1.2.2.2 连翘酯苷A的提取方法 溶剂回流提取法:基于连翘酯苷A能溶于水和乙醇等溶剂,实验室中常采用溶剂回流提取的方法从连翘叶中提取连翘酯苷A,不同提取溶剂提取出的连翘酯苷A含量不同。梅雪等[12]在从连翘叶中提取连翘酯苷A时,以水、70%乙醇和甲醇分别作为溶剂,提取物中连翘酯苷A含量分别为3.32%、5.36%和8.16%。靖会等[28]对不同浓度乙醇(10%、30%、50%、70%、95%)提取连翘酯苷A的效果进行了比较,50%乙醇作为提取剂时,连翘酯苷A的提取率最高,为96.4%,使用95%乙醇提取时,提取率仅为70.22%。目前实验室中常采用水、乙醇、甲醇等作为提取连翘酯苷A的溶剂,其中乙醇和甲醇的提取效果较好,但乙醇和水更安全,因此实验室中常采用50%～60%的乙醇提取连翘酯苷A。

有机溶剂萃取法:有机溶剂萃取法是在溶剂提取出连翘酯苷A的基础上,继续加入石油醚、正丁醇等有机溶剂,以达到除去脂溶性色素和水溶性杂质,纯化连翘酯苷A的目的。曹克红等[29]采用有机溶剂萃取与色谱柱精制相结合的方法,成功从连翘叶中提取出纯度在95%～99%之间的连翘酯苷A,提取率达到3.5%～5.5%。利用有机溶剂从连翘叶中萃取连翘酯苷A可以降低后期纯化连翘酯苷A 的工艺难度,具有节约纯化时间的优点,同时提取出的连翘酯苷A纯度较高。

离子液体萃取法:离子液体(Ionic Liquid,ILs)是完全由离子组成的低熔点盐液体,具有波动小、范围大等优点,已广泛用于样品浓缩、分析和分离等过程。目前,离子液体已经被公认为优秀的溶剂分离的生物活性同系物[30-31]。Sun等[32]研究了利用离子液体-基底交联辅助萃取法(ILUAE)从连翘叶中提取连翘酯苷A和I的方法,该方法可从连翘叶中提取出产量为10.74%的连翘酯苷A,经纯化后,连翘酯苷A的纯度可达到97.9%。目前国内利用离子液体从连翘叶中提取化学成分的研究较少,可能与离子液体不易回收有关,因此,利用离子液体从连翘叶中提取连翘酯苷A的参考数据较少,有待学者们深入研究。

微波辅助低共熔溶剂提取法:微波辅助低共熔溶剂(Deep Eutectic Solvents,DESs)提取技术是近年来兴起的新型提取技术,可应用于从连翘叶中提取连翘酯苷A。周立锦等[33]研究发现,与传统方法比,微波辅助DESs技术具有更好的破壁效果,连翘酯苷A的提取率也更高,可达到137.62 mg/g。董哲[34]研究微波辅助DESs技术提取连翘酯苷A,发现 DES-B3作为提取溶剂时提取出的连翘酯苷A更稳定。可见,DESs可以代替传统溶剂从连翘叶中提取连翘酯苷A,在微波辅助技术下,提取效果更好,同时该方法与其他方法相比具有绿色环保的优点。但DESs是混合溶剂,因此在提取时应先对DESs进行筛选,确定从连翘叶中提取连翘酯苷A的最佳溶剂组合,以提高提取率。

浸提与柱层析联用法:从连翘叶中提取连翘酯苷A时会提取出连翘苷、芦丁等其他成分,为提取出高纯度的连翘酯苷A,学者们常采用浸提与柱层析联用的方法。杨建雄等[35]发明了乙醇浸提与柱层析联用的连续提取工艺,在连翘叶乙醇提取液中成功分离得到纯度>92%的连翘酯苷A。孙建瑞等[22]在采用53%乙醇溶液水浴浸提方法提取连翘酯苷A的基础上,用大孔吸附树脂和反相层析技术对连翘酯苷A进行了纯化,纯化后的连翘酯苷A的纯度>97%。原江锋等[36]首先使用溶剂提取和柱层析技术制得粗连翘酯苷A,再使用反相硅胶色谱柱层析技术继续纯化,连翘酯苷A纯度从62%提高到92%。浸提与柱层析联用法可以大大提高连翘酯苷A 的纯度,但是柱层析的时间较长,提取效率较低,有待进一步优化。

1.2.2.3 连翘脂素的提取方法 连翘脂素在连翘叶中含量较少,不易直接提取。邓祥敏等[37]采用水提醇沉萃取的方式,在连翘叶中萃取出纯度>75%的连翘脂素粗品,继续进行甲醇结晶,连翘脂素纯度>99%。在连翘叶中连翘苷的含量较高,同时连翘脂素是连翘苷的苷元,因此连翘苷可以通过水解的方式转化成连翘脂素。目前提取连翘脂素的方法多是由连翘苷转化为连翘脂素,使连翘脂素的含量提高,再进行提取。常用的转化方法包括酶法和发酵法。樊宏宇等[38]采用酶法将连翘苷转化为连翘脂素,其工艺流程如图1所示。

图1 连翘苷转化连翘脂素的酶法工艺流程Fig.1 Enzymatic process of conversion from phillyrin into phillygenin

酶法转化需大量的纤维素酶,成本较高,而微生物发酵法不仅工艺流程简单,而且节约成本,因此,采用微生物发酵法将连翘苷转化为连翘脂素受到更多学者的研究和关注。梅建凤等[39]对连翘苷转化为连翘脂素的发酵菌种进行了分离和筛选,最终选用的菌株LB使连翘脂素的转化率高达94.1%。汪青波等[14]通过发酵使连翘叶中的连翘苷大量转化为连翘脂素,将连翘叶中的连翘脂素含量从1.67 mg/g提高到46.40 mg/g。

1.2.3 化学成分含量的影响因素

1.2.3.1 不同采收时期连翘叶化学成分含量 连翘叶的化学成分含量受采收期的影响。Morimoto等[40]研究表明,连翘干叶中木脂素类(松脂酚、罗汉松树脂酚、牛蒡子苷元)的苷元和糖苷总含量普遍在6月份时最高,其中牛蒡子苷元的含量>30 mg/g。通过比较不同采收时期连翘叶中化学成分含量显示,在不同地区,连翘叶中的连翘苷和连翘酯苷A均在4～6月份时含量较高(图2)[13,18,41]。王雨虹等[42]采用高效液相色谱(HPLC)技术,对太原地区采收期为6～10月的连翘叶中连翘苷等成分的含量进行了测定,结果显示,连翘叶中连翘苷和连翘酯苷在6月最高,分别为10.35和67.25 mg/g,8～10月份含量不断下降。朱凤云[43]等研究了连翘叶在4月到10月期间连翘苷含量的变化情况,发现5月份最高(含量为12.827%),10月份最低(含量为1.520%)。分析原因可能是,在每年4～5月份连翘叶萌发新芽,按照连翘叶的生长周期规律,在4～6月份大多地区连翘叶中的化学成分含量是最高的。

图2 不同地点(A、B、C)不同月份采收的连翘叶化学成分含量Fig.2 Chemical composition of Forsythia suspensa leaves harvested in different locations(A,B,C)in different months注:A:2011年河北井陉县洞阳坡;B:2011年河南灵宝朱阳山;C:2016年山西大学校内。

1.2.3.2 不同产地连翘叶化学成分含量 产地也会影响连翘叶中的化学成分含量。原江锋等[44]采用液质联用(LC-MS)技术,分析了不同产地连翘叶和连翘花中的活性成分含量,结果表明,不同产地的连翘叶、花的化学成分组成基本一致,但含量有所差别:在16个地区中,山西临汾和山东泰安的连翘叶的芦丁含量分别为(2.84±0.06)和(0.47±0.03) mg/g;洛阳龙门和河南卢氏所产连翘叶中连翘苷含量分别为(45.72±0.41)和(12.45±0.12) mg/g;不同产地连翘叶中连翘酯苷A的含量差别最为明显,陕西西安的连翘叶中连翘酯苷A含量为(53.22±0.43) mg/g,而陕西洛南的连翘叶中连翘酯苷A含量仅为(2.64±0.03) mg/g。杨棣华等[45]测定了不同产地连翘叶中连翘酯苷A和连翘苷的含量,发现二者含量分别在2.96%～5.28%和2.14%～4.01%之间。不同产地中连翘叶化学成分含量具有差异性,可能与产地的水源、气候和土壤条件等因素有关。

1.2.3.3 不同加工方式下连翘叶化学成分含量 不同加工方式对连翘叶中化学成分的含量影响明显,表4列出了不同加工方式对连翘叶化学成分含量的影响。李蒙蒙[46]考察了加工方式对连翘叶中连翘脂素等成分含量的影响,结果显示,在不同烘干条件下,炒制并在80 ℃下烘干的连翘叶中连翘脂素的含量最高(在0.2%以上),其次是蒸制,烫制后的连翘脂素含量最低(小于1%);在烫制法干燥后,连翘酯苷A的含量最高,其次是蒸制和炒制。麻景梅等[47]对不同干燥条件下连翘叶茶中的连翘苷等成分的含量进行了测定,发现在不同干燥条件下,连翘叶茶中黄酮含量较稳定,连翘苷的含量在通风阴干24 h的条件下最高(6.89 mg/g),在100 ℃鼓风干燥的条件下最低(3.09 mg/g)。与晒干相比,烘干后的连翘苷和连翘酯苷A更易保存;蒸、炒后干燥对连翘苷和连翘酯苷A的保存效果更好,可能与蒸、炒的杀酶保苷作用有关[48];煮制阴干时连翘酯苷A含量更高,可能是因为煮制时连翘叶的部分连翘酯苷A溶解在水中,更容易被溶剂提取[49]。在75%乙醇溶解,超声处理的提取方法下,微波干燥的加工方式使连翘叶中的连翘酯苷含量更高,但成本较高,在应用上会受到限制[50]。综合考虑,采用蒸后阴干或烘干的加工方式更有利于连翘叶中化学成分的保留,同时成本不会过高,更适合应用于工业化生产。

表4 不同加工方式下连翘叶化学成分含量Table 4 Chemical composition of Forsythia suspensa leaves under different processing methods

2 生物活性

2.1 抗病毒活性

研究表明,连翘苷和连翘酯苷具有较强的抗病毒活性[52-55]。Qu等[52]为了发现新的抗流感药物,在体内研究了连翘苷对甲型流感病毒感染的抗病毒作用,在感染A型流感病毒的小鼠中,以20 mg/kg/d的剂量连续3 d给药可显著延长小鼠的平均生存时间,减轻了肺组织损伤,表明连翘苷对A型流感病毒感染具有潜在的保护作用。玄振玉等[53]也证实了高纯度的连翘酯苷具有体外抗流感甲型病毒及退热作用,可应用于抗病毒药物。在新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)的预防和治疗中,传统中药被广泛采用,特别是在治疗症状较轻的病例中,其中连花清瘟胶囊在抗击新冠肺炎中表现出良好疗效。钟南山研究团队在分析武汉医院收治的COVID-19患者临床资料的基础上,在透射电镜下观察莲花清温胶囊对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)粒子形态的影响,结果证实了连花清瘟胶囊可明显抑制SARS-CoV-2的复制,并在体外发挥抗炎作用[54]。Cheng等[55]采用柔性对接方法,将连花清瘟胶囊中21种化合物和SARS-CoV-2的主要蛋白酶进行对接打分,结果显示,芦丁、连翘脂苷E、金丝桃苷的分数均优于洛匹那韦(Lopinavir)。其中,金丝桃苷可能是SARS-CoV-2主要蛋白酶的抑制剂。

尽管上述研究中所用原料都是连翘果,但发挥功效的成分,比如连翘苷、连翘脂苷A、金丝桃苷等,在连翘叶中也大量存在,并且连翘苷和连翘酯苷A的含量在连翘叶中远高于连翘果,因此从连翘叶中分离的化合物有望成为抗COVID-19的一个新的药物筛选方向。

2.2 抗菌活性

连翘叶的乙醇提取物具有广谱抗菌作用。王小敏等[17]测定了连翘叶乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度,为3.125 mg/mL,与连翘果乙醇提取物的最低抑菌浓度(6.25 mg/mL)相比,连翘叶乙醇提取物的抑菌效果更好。张元波[56]对连翘叶抗菌作用的化学物质基础进行了研究,发现连翘叶提取物中的连翘酯苷A和连翘酯苷I是抗菌的基础物质,从连翘叶提取出的连翘酯苷A与头孢唑林、万古霉素两种抑制剂共同使用时,抑菌效果会增强(表5)。

表5 连翘酯苷A与头孢唑林、万古霉素共用时的抑菌效果Table 5 Antibacterial effect of sythiaside A combined with cefazolin and vancomycin

2.3 抗氧化活性

科学研究表明,人体衰老是自由基不断氧化从而引发组织损伤的结果,而自由基的平衡可以通过补充抗氧化剂来调节,因此,从植物材料中提取更安全的天然无毒的抗氧化剂来代替人工合成的抗氧化剂已经引起了学者们的关注。连翘叶中含有连翘酯苷A和酚类等活性成分,具有较强的抗氧化活性。张元波等[57]对连翘叶提取物进行了抗氧化测定,认为酚类是连翘叶抗氧化的物质基础。Jiao等[41]利用LC-MS/MS技术对连翘叶泡茶液中主要活性成分进行了比较,并测定了其抗氧化活性,结果显示连翘叶中的主要活性物质在早期(4月)的含量最高,并且抗氧化能力最强。Yuan等[58]采用多种生化方法筛选了粗连翘苷、纯化连翘苷、粗连翘酯苷和纯化连翘酯苷的抗氧化性能。结果表明,连翘酯苷具有较强的DPPH自由基清除能力、还原力和脂质过氧化作用,其水平优于丁基羟基甲苯(Butylated Hydroxytoluene,BHT),浓度为25～30 μg/mL的纯化连翘酯苷的DPPH自由基清除活性>90%,表明连翘叶可作为天然抗氧化剂的经济膳食来源,改善人体健康。

2.4 保肝功效

研究发现连翘叶茶有保护肝脏的功效。刘静[59]通过小鼠模型实验发现连翘叶茶提取物能够显著提高肝损伤小鼠血清中总胆红素(Total Bilirubin,TBIL)和蛋白质(Protein,TP)的含量,表明连翘叶茶可改善肝损伤小鼠胆红素的代谢和肝脏合成蛋白质的功能。白美美[60]以醉酒小鼠血清中的血浆抗利尿激素(Antidiuretic Hormone,ADH)活性作为检测指标,测定了连翘叶红茶、绿茶对小鼠的解酒功效,模型组小鼠的醒酒时间为(494.8±34.1) min,给予连翘叶红茶及绿茶后,小鼠醒酒时间缩短,其中绿茶高剂量组(18 g/kg)小鼠的醒酒时间仅为(254.7±107.5) min,同时连翘叶茶使酒精中毒小鼠血清的ADH活性升高,表明连翘叶茶可以减轻酒精中毒小鼠的肝脏受损程度。

2.5 降血脂、血糖功效

周菲[18]在实验中发现,连翘叶粗提物可以抑制的胰脂肪酶(Pancreatic Lipase,PL)活性,既减少了人体对脂肪的吸收,又降低了血脂,其中6月份的连翘叶提取物对PL的抑制率最高,粗提取浓度为1000 μg/mL时抑制率达到46.64%。Kang等[61]从连翘叶中提取出连翘脂素和槲皮素等五种化合物,并对五种化合物的降血脂功效进行了研究,服用芦丁后,小鼠血清中的总胆固醇含量为3.124 mmol/L,而高胆固醇饮食组的小鼠血清中总胆固醇含量为4.402 mmol/L,表明芦丁具有较高的降血脂活性,Kang等认为这与芦丁等化合物的抗氧化机制有关。Xu等[62]从连翘叶中分离得到连翘苷等活性成分,研究了其对脂肪细胞胰岛素抵抗机制的影响,结果显示连翘苷在100和200 μmol/L的浓度下有显著增加葡萄糖消耗的作用,改善了胰岛素的抵抗机制,起到降血糖的作用。

3 展望

连翘作为中药在中国的使用历史已经十分悠久,常作为连花清瘟胶囊等中成药的主要药物原料,用来治疗外感风热等病症,这些中成药针对目前全球流行的新冠肺炎病毒也有一定的抑制作用。连翘叶同连翘果一样,也含有多种清热解毒的活性物质,如连翘苷、连翘酯苷A、连翘脂素等活性成分,表明从连翘叶中提取分离化合物有望成为抗COVID-19的一个新的药物筛选方向。

随着科学家对连翘资源研究的不断深入,除了目前学者研究的活性成分外,连翘叶中还有更多未知的活性成分有待发掘,还可以利用新的提取技术,如正渗透、超滤、纳滤、膜萃取、超临界流体萃取等,从连翘叶中提取具有药理作用的活性成分,针对不同的活性成分分别或联合进行研究。另外,从连翘叶中提取活性成分的工艺设备仍需要不断创新,将其应用于实际生产中,以提高目标产物的提取率及纯度。

目前国内市场上常见的连翘叶产品只有连翘叶茶,其制备工艺较为成熟,但产品种类较单一,可以将连翘叶与其他食品原料相结合,研发具备减肥、保肝、抗疲劳、降血脂、降血糖、抗菌、抗病毒等功效的一系列功能性食品,比如茶饮品、饼干、面包等,可大大提高连翘叶的经济附加值和综合开发程度,对于壮大连翘叶“种植-初加工-深加工-销售”产业链的发展具有重要意义。